猪肺炎支原体强弱毒菌株比较蛋白质组学分析及差异表达蛋白mhp390的功能研究.pdfVIP

猪肺炎支原体强弱毒菌株比较蛋白质组学分析及差异表达蛋白mhp390 的功能研究 目 录 目 录I 摘 要 i Abstract iii 缩略语表（Abbreviation ） vi 第一章 文献综述 1 1.1 蛋白质组学研究技术 1 1.1.1 蛋白质组学技术概述 1 1.1.2 iTRAQ 技术 2 1.2 猪肺炎支原体的研究进展 4 1.2.1 病原学 4 1.2.2 流行病学 5 1.2.3 致病机制 5 1.2.4 组学研究进展 14 1.2.5 猪肺炎支原体病的诊断 17 1.2.6 猪肺炎支原体病的防治 18 1.3 猪肺炎支原体强毒菌株168 株和弱毒菌株168L 株的毒力差异 22 第二章 猪肺炎支原体强弱毒菌株比较蛋白质组学的研究 25 2.1 研究目的与意义 25 2.2 材料与方法 25 2.2.1 菌种与培养基 25 2.2.2 载体 26 2.2.3 实验动物 26 2.2.4 主要实验相关材料和试剂 26 2.2.5 主要实验仪器及设备 29 2.2.6 猪肺炎支原体的复苏与培养 29 2.2.7 猪肺炎支原体生长曲线的测定 30 2.2.8 用于iTRAQ 分析的猪肺炎支原体全菌样品制备 30 2.2.9 全菌蛋白的提取 30 2.2.10 蛋白浓度的测定 31 2.2.11 蛋白质酶解 31 2.2.12 iTRAQ 标记 31 I 华中农业大学2019 届博士研究生学位论文 2.2.13 SCX 分离 31 2.2.14 基于Triple TOF 5600 的LC-ESI-MS/MS 分析 32 2.2.15 蛋白鉴定和定量 32 2.2.16 生物信息学分析 33 2.2.17 部分差异表达蛋白的原核表达与纯化 34 2.2.18 重组蛋白抗血清的制备 43 2.2.19 Western blot （Stain free 法）对差异表达蛋白的验证 44 2.2.20 数据分析 45 2.3 结果与分析 45 2.3.1 猪肺炎支原体生长曲线的测定 45 2.3.2 全菌蛋白样品信息 46 2.3.3 蛋白鉴定信息 47 2.3.4 差异表达蛋白信息 50 2.3.5 差异表达蛋白的原核表达纯化与Western blot 验证 54 2.3.6 基于TGX stain free 技术的Western blot 验证差异表达蛋白 56 2.4 讨论 57 2.4.1 参与肌醇代谢的蛋白 57 2.4.2 参与核苷酸代谢的蛋白 59 2.4.3 潜在毒力因子 60 第三章 差异表达蛋白mhp390 的功能研究 68 3.1 研究目的与意义 68 3.2 材料与方法 68 3.2.1 载体 68 3.2.2 主要实验相关材料和试剂 69 3.2.3 Mhp390 蛋白结构的生物信息学分析 70 3.2.4 Mhp390 的原核表达与纯化 71 3.2.5 Mhp390 原核表达蛋白的内毒素去除与检测 73 3.2.6 Mhp390 兔抗血清的制备 74 3.2.7 Mhp390 蛋白在猪肺炎支原体中的亚细胞定位 74 3.2.8 Mhp390 原核表达蛋白的纤毛黏附实验 75 3.2.9 猪外周血单个核细胞和原代肺泡巨噬细胞的制备 76 3.2.10 Annexin V-F