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狂犬病疫苗诱导的 TLR4 依赖的体液免疫应答机制 目 录 摘 要 i 关键词ii Abstract iii Keywords iv 缩略词表（List of abbreviation ） v 1 前言 1 1.1 狂犬病危害 1 1.2 病原学特点 2 1.2.1 核蛋白 3 1.2.2 磷蛋白 4 1.2.3 基质蛋白 4 1.2.4 糖蛋白 5 1.2.5 RNA 聚合酶 6 1.3 传播特性 6 1.4 狂犬病防治 8 1.5 免疫应答反应 11 1.5.1 天然免疫应答 11 1.5.2 适应性免疫应答 16 1.6 TLRs 信号通路 19 1.7 TLR4 与免疫应答 21 1.7.1 TLR4 与PAMPs 23 1.7.2 TLR4 与DAMPs 24 2 目的及意义 26 3 材料和方法 27 3.1 实验材料 27 3.1.1 病毒和细胞系 27 3.1.2 小鼠资源 27 3.1.3 常规药品和试剂 27 I 华中农业大学 2020 届博士研究生学位（毕业）论文 3.1.4 PCR 相关试剂27 3.1.5 细胞培养相关试剂27 3.1.6 细胞流式相关试剂28 3.1.7 ELISA 相关试剂28 3.1.8 单克隆抗体29 3.1.9 商品化试剂盒30 3.1.10 实验器材30 3.2 实验方法31 3.2.1 小鼠基因型鉴定31 3.2.2 蔗糖密度梯度纯化32 3.2.3 动物实验33 3.2.4 分离培养原代细胞34 3.2.5 流式细胞术35 3.2.6 免疫荧光组织化学（IFH ）37 3.2.7 酶联免疫斑点实验（ELISpot ）37 3.2.8 荧光抗体病毒中和试验（FAVN ）38 3.2.9 ELISA39 3.2.10 统计学方法39 4 结果与分析40 4.1 小鼠基因鉴定40 4.1.1 TLR4-/-纯合子验证40 4.1.2 TLR2-/-纯合子筛选40 4.1.3 小结42 4.2 TLR2 和TLR4 对狂犬病疫苗诱导的体液免疫应答的影响42 4.2.1 TLR4 缺失显著减少VNA 和总IgG 产生42 4.2.2 TLR2 缺失未影响VNA 和总IgG 产生43 4.2.3 小结45 4.3 TLR4 缺失不影响RABV 诱导的APCs 成熟45 4.3.1 TLR4 缺失不影响RABV 诱导的BMDC 成熟45 4.3.2 TLR4 缺失不影响RABV 诱导的Pan-B 细胞成熟46 狂犬病疫苗诱导的 TLR4 依赖的体液免疫应答机制 4.3.3 TLR4 缺失不影响RABV 诱导的cDCs 成熟 48 4.3.4 RABV 和MPLA 诱导cDC2 招募 49 4.3.5 小结 51 4.4 TLR4 促进RABV 诱导的体液免疫应答 51 4.4.1 TLR4 促进cDC2 招募 51 4.4.2 TLR4 促进Tfh 分化 53 4.4.3 TLR4 平衡Th1 型和Th2 型免疫反应 55 4.4.4 TLR4 促进GC B 增殖 57 4.4.5 TLR4 促进GCs 形成 59 4.4.6 TLR4 促进PCs 生成 61 4.4.7 小结 62 4.5 TLR4 佐剂MPLA 提高狂犬病疫苗免疫效率 62 4.5.1 MPLA 促进BMDCs 成熟 63 4.5.2 MPLA 促进RABV 特异性VNA 和总IgG 产生 64 4.5.3 MPLA 促进cDCs 成熟 66 4.5.4 MPLA 促进Tfh 分化 68 4.5.5 MPLA 促进GC B 增殖 69 4.5.6 MPLA 促进PCs 生成 71 4.5.7 小结 72 5 讨论 74 5.1 TLR4 促进Th1 型免疫反应和高亲和力VNA 产生 74 5.2 TLR4 促进淋巴器官招募cDC2 用于激活Tn 向Tfh 分化 75