原核生物Argonaute（pAgo）蛋白介导细菌基因组编辑及其机制研究.pdfVIP

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2021-01-09 发布于江苏
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原核生物Argonaute（pAgo）蛋白介导细菌基因组编辑及其机制研究.pdf

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原核生物Argonaute (pAgo)蛋白介导细菌基因组编辑及其机制研究目录摘要 i Abstract iv 缩略语表（Abbreviation ）vii 第一章前言 1 1.1 研究问题的由来 1 1.2 细菌经典遗传操作系统 2 1.2.1 转座酶系统 2 1.2.2 位点特异性重组系统 6 1.2.3 同源重组系统 9 1.3 基于新型基因编辑技术的细菌遗传操作系统研究进展 25 1.3.1 基于CRISPR/Cas9 基因编辑技术的细菌遗传操作系统研究进展 25 1.3.2 基于碱基编辑器的细菌遗传操作系统研究进展 28 1.4 原核生物Ago(pAgo)蛋白的研究进展 30 1.4.1 Ago 蛋白概述 30 1.4.2 Ago 蛋白介导RNA 干扰 32 1.4.3 pAgo 蛋白的DNA 水解酶活性 34 1.4.4 pAgo 蛋白在基因编辑中的应用 36 第二章研究目的及意义 39 第三章材料和方法 40 3.1 质粒、菌株及其培养条件 40 3.2 主要试剂耗材 44 3.3 实验仪器 45 3.4 培养基配制 46 3.5 主要试剂配制 46 3.5.1 主要缓冲液 46 3.5.2 蛋白表达及纯化试剂 47 3.5.3 SDS及Western Blot 相关试剂 47 3.5.4 IP 及Chip 实验试剂 49 3.6 引物设计及基因合成 49 3.7 NgAgo 系统能否介导大肠杆菌靶基因缺失的研究 50 I 华中农业大学2020 届博士研究生学位论文 3.7.1 大肠杆菌aste 基因敲除的相关质粒的构建50 3.7.2 NgAgo 能否介导大肠杆菌aste 基因缺失的检测55 3.8 NgAgo 介导细菌基因敲除是否依赖gDNA 靶向的DNA 酶活性的研究58 3.8.1 DNA 酶活性位点突变的NgAgo 相关质粒的构建58 3.8.2 DNA 酶活性位点突变的NgAgo 能否介导GX-PM 基因缺失的检测...58 3.8.3 T7E1 方法检测NgAgo 蛋白的DNA 酶活性60 3.8.4 不引入外源gDNA 时NgAgo 能否介导GX-PM 靶基因缺失的检测...61 3.8.5 NgAgo 介导细菌靶基因敲除是否依赖提高同源重组效应的检测62 3.9 NgAgo 提高同源重组效率的机制研究63 3.9.1 NgAgo 蛋白两端融合Flag 标签是否影响其介导基因缺失的检测63 3.9.2 应用IP 偶联质谱方法鉴定NgAgo 在细菌中的互作蛋白63 3.9.3 Co-IP 检测NgAgo 蛋白与细菌内源性recA 的互作65 3.9.4 Co-IP 检测DNaseI 处理后NgAgo 蛋白与recA 的互作67 3.9.5 重组蛋白recA 及NgAgo 的原核表达质粒的构建68 3.9.6 重组蛋白recA 及NgAgo 的表达及纯化68 3.9.7 重组蛋白NgAgo 与recA 互作的检测71 3.9.8 SPR 方法检测重组蛋白NgAgo 与recA 的互作亲和力72 3.9.9 EMSA 方法检测NgAgo 蛋白能否增加recA 蛋白与ssDNA 的结合...74 3.9.10 NgAgo 蛋白能否增强recA 蛋白介导的DNA 链交换能力的检测75 3.9.11 Chip-qPCR 方法检测NgAgo 蛋白能否增加recA 与细菌内同源靶序列