基于PacBio的高通量Fosmid文库克隆长配对末端测序技术的开发.pdfVIP

基于PacBio 测序平台的高通量Fosmid 文库克隆末端测序技术的开发 目 录 摘 要 i Abstract iii 缩略语表 v 1 前言 1 1.1 DNA 测序技术 1 1.1.1 DNA 测序技术的发展 1 1.1.2 DNA 测序技术的应用 7 1.2 DNA 文库 10 1.2.1 DNA 文库的发展 10 1.2.2 DNA 文库的应用 14 1.3 谷子的研究背景 16 1.4 酵母的研究背景 19 1.5 本研究的目的和意义 19 2 材料与方法 21 2.1 材料 21 2.2 实验仪器与试剂 21 2.3 实验方法 22 2.3.1 pHZAUFOS3 载体改造流程 22 2.3.2 pHZAUFOS3 载体的大量制备 22 pHZAUFOS3 质粒提取 22 2.3.3 高质量高分子基因组DNA 提取 25 包埋法提取酵母基因组DNA 25 2.3.4 基因组DNA 的预打断 27 2.3.5 基因组DNA 的大量打断 28 2.3.6 DNA 的末端修复 28 2.3.7 目的DNA 片段的胶回收 29 2.3.8 目的DNA 连接载体 29 2.3.9 重组质粒的体外包装及感受态细胞的制备 30 I 华中农业大学2019 届博士研究生学位 （毕业）论文 2.3.10 噬菌体的侵染和滴度测定30 2.3.11 Fosmid 文库的单克隆获取、复制、保存30 2.3.12 Fosmid 文库的质量检测31 2.3.13 Paired-end 末端测序文库构建32 2.4 Paired-end 末端测序数据分析38 2.4.1 原始数据38 2.4.2 原始数据经CCS 校正38 2.4.3 CCS 数据提取FESs （Fosmid end sequences ）38 2.4.4 FESs 比对到参考基因组38 2.4.5 sam 文件分析39 2.4.6 FESs 正确率统计40 2.5 Paired-end 末端序列辅助基因组组装40 2.5.1 模拟PacBio 全基因组测序数据并组装contigs 40 2.5.2 Scaffolds 组装41 2.6 Paired-end 末端序列鉴别结构变异位点42 2.6.1 单末端结构变异位点识别42 2.6.2 双末端结构变异位点识别42 2.7 Paired-end 末端序评估Yugu18 基因组组装质量43 2.7.1 Yugu18 与Yugu1 全基因组比对43 2.7.2 利用FESs 对Yugu18 基因组做正确率统计评估43 3 结果与分析44 3.1 pHZAUFOS3 载体的改造44 3.2 pHZAUFOS3 载体的大量制备质量检测48 3.3 酵母Y2 Fosmid 文库构建及质量检测48 3.4 谷子S2 Fosmid 文库构建及质量检测49 3.5 Fosmid 克隆混合池Paired-end 末端测序文库构建及质量检测50 3.5.1 Fosmid 文库克隆混合池质粒DNA 的打断51 3.5.2 Fosmid 文库克隆混合池质粒DNA 的回收53 3.5.3 Fosmid 克隆混合池Paired-end 末端测序文库质量检测54 3.6 Fosmid 克隆混合池Paired-end 末端测序文库测序样品制备54 II