硫化叶菌Csa3家族蛋白调控CRISPR免疫适应和干涉机制的研究.pdfVIP

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2021-01-09 发布于江苏
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硫化叶菌Csa3家族蛋白调控CRISPR免疫适应和干涉机制的研究.pdf

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硫化叶菌Csa3 家族蛋白调控CRISPR 免疫适应和干涉机制的研究目录摘要i Abstract iii 缩略语表v 1 前言1 1.1 CRISPR-Cas 系统简介 1 1.2 CRISPR-Cas 系统的分类和分布2 1.2.1 CRISPR-Cas 系统的分类2 1.2.2 CRISPR-Cas 系统的分布4 1.3 CRISPR-Cas 系统的免疫机制5 1.3.1 CRISPR-Cas 适应6 1.3.2 crRNA 加工8 1.3.3 CRISPR 干涉 10 1.4 CRISPR-Cas 系统的调控 13 1.5 转录调控蛋白Csa3a 和Csa3b 16 1.6 环寡腺苷酸cOA 在CRISPR-Cas 系统中的功能20 1.6.1 CRISPR-Cas 中cOA 的合成及调控通路20 1.6.2 环寡腺苷酸 cOA 的降解24 1.7 CRISPR-Cas 系统的应用26 1.8 冰岛硫化叶菌简介28 1.9 研究目的和意义29 2 材料与方法31 2.1 菌株与质粒31 2.2 培养基配方及培养条件33 2.3 主要分子生物学试剂35 2.4 主要实验仪器36 2.5 实验方法37 I 华中农业大学2020 届博士研究生学位论文 2.5.1 大肠杆菌和硫化叶菌感受态的制备和转化方法37 2.5.2 冰岛硫化叶菌生长曲线测定38 2.5.3 基因敲除38 2.5.4 RNA 抽提和转录组分析39 2.5.5 Western blot 实验40 2.5.6 凝胶阻滞分析（EMSA ）41 2.5.7 DNaseI 足迹分析实验(DNaseI Footprinting) 41 2.5.8 局部表面等离子共振实验（LSPR ）42 2.5.9 突变菌株的构建和蛋白纯化42 2.5.10 蛋白质质谱44 2.5.11 免疫适应检测及分析45 2.5.12 DNA 干涉分析46 2.5.13 RNA 干涉分析46 2.5.14 STSV2 病毒的浓缩和细胞侵染47 2.5.15 环状寡腺苷酸cOA 的合成和紫外交联实验48 3 结果与分析49 3.1 csa3b 基因过表达菌株抑制细胞生长49 3.1.1 过表达csa3b 基因严重抑制细胞生长49 3.2.2 csa3b 过表达转录组分析50 3.2 Csa3b 蛋白抑制CRISPR 适应54 3.2.1 Csa3b 结合csa1 启动子54 3.2.2 Δcsa3b 菌株从质粒中获取spacer 56 3.2.3 Δcsa3b 菌株从病毒STSV2 中获取spacer57 3.2.3.1 STSV2 病毒富集和浓度检测57 3.2.3.2 STSV2 病毒侵染生长曲线测量和获取PCR 验证58 3.2.4 protospacer 分析61 3.3 Csa3b 蛋白增强III-B 系统的RNA 干涉活性62 3.3.1 Csa3b 蛋白结合cmr 启动子63