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转录因子MpbR 驱动的结核分枝杆菌脂质生物合成调控及病原-宿主相互作用研究 目录 中文摘要i Abstractiii 缩略语表vi 1 前言1 1.1 结核分枝杆菌的囊膜结构2 1.2 分枝杆菌囊膜中脂质的合成及运输4 1.3 分枝杆菌囊膜的细菌学功能7 1.3.1 影响细菌的生长及分裂7 1.3.2 影响细菌的通透性8 1.3.3 影响细菌生物被膜形成9 1.3.4 影响细菌的菌落形态10 1.4 分枝杆菌囊膜的免疫学功能11 1.4.1 影响分枝杆菌对宿主细胞的入侵11 1.4.2 影响吞噬体的成熟14 1.4.3 影响宿主的免疫应答15 1.5 磷脂酰肌醇甘露糖 （PIMs）是分枝杆菌囊膜的重要组分16 1.5.1PIMs 的生物合成16 1.5.2PIMs 的运输及定位18 1.5.3PIMs影响分枝杆菌生理机能20 1.5.4PIMs影响分枝杆菌侵染宿主细胞21 1.5.5PIMs影响吞噬体成熟22 1.5.6PIMs激活宿主免疫应答22 1.5.7PIMs抑制宿主免疫应答25 1.5.8PIMs作为免疫佐剂26 1.6 分枝杆菌囊膜中脂质合成的转录调控26 1.6.1 脂肪酸的合成调控27 1.6.2 复杂脂质的合成调控28 I 华中农业大学2019 届博士研究生学位论文 1.7 本研究的目的、意义和思路28 1.7.1 本研究的目的和意义28 1.7.2 本研究的思路29 2 材料与方法31 2.1 材料31 2.1.1 菌株31 2.1.2 质粒32 2.1.3 引物34 2.1.4 培养基37 2.1.5 抗生素39 2.1.6 其他试剂配方39 2.1.7 试剂与试剂盒43 2.1.8 仪器44 2.2 方法44 2.2.1TM4 噬菌体的扩增44 2.2.2 耻垢分枝杆菌转座子插入突变体文库的构建45 2.2.3 耻垢分枝杆菌菌落形态变化突变体筛选45 2.2.4 耻垢分枝杆菌突变体测序45 2.2.5 分枝杆菌重组菌株的构建46 2.2.6 耻垢分枝杆菌生长曲线的测定46 2.2.7 结核分枝杆菌生长曲线的测定47 2.2.8 耻垢分枝杆菌生物被膜的培养47 2.2.9 结晶紫染色实验定量检测耻垢分枝杆菌生物被膜47 2.2.10 结核分枝杆菌生物被膜的培养47 2.2.11 结晶紫染色实验定量检测结核分枝杆菌生物被膜48 2.2.12 结核分枝杆菌小鼠肺部存活的测定48 2.2.13 小鼠肺部病理切片实验48 2.2.14 结核分枝杆菌脂质组测序49 II 转录因子MpbR 驱动的结核分枝杆菌脂质生物合成调控及病原-宿主相互作用研究 2.2.15 结核分枝杆菌转录组测序49 2.2.16 实时荧光定量PCR （qRT-PCR）实验50 2.2.17 蛋白质纯化50 2.2.18EMSA51 2.2.19 竞争性EMSA51 2.2.20DNaseI 足迹实验51 2.2.21 细菌单杂交实验 （B1H）52 2.2.22 染色质免疫沉淀实验 （ChIP）52 2.2.23 β-半乳糖苷酶活性实验53 2.2.24 制备骨髓源巨噬细胞 （BMDM）53 2.2.25BMDM 细胞转录组