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WT1 对鸡排卵前颗粒细胞孕酮合成的影响 目录 摘要 i ABSTRACT iii 缩略词表 v 1 前言 1 1.1 研究问题的由来 1 1.2 文献综述 1 1.2.1 鸡卵泡的生长和发育 1 1.2.2 颗粒细胞在卵泡发育与卵泡选择中的作用 2 1.2.3 卵泡发育过程中的类固醇激素合成 3 1.2.4 WT1 的结构及功能 5 1.3 研究目的及意义 6 2 材料与方法 6 2.1 实验动物 6 2.2 试剂及仪器 7 2.2.1 主要仪器 7 2.2.2 主要试剂及耗材 8 2.2.3 溶液配制 8 2.3 试验方法 9 2.3.1 蛋鸡颗粒细胞分离及原代培养 9 2.3.2 组织/细胞RNA 提取 10 2.3.3 定量PCR 10 2.3.4 孕酮浓度测定 13 2.3.5 总蛋白提取及Western blot 检测 13 2.3.6 WT1 过表达载体构建 15 2.3.7 细胞转染 18 2.3.8 数据统计、分析及相关软件 18 3 结果 19 3.1 WT1 在鸡卵泡颗粒中的表达 19 3.2 WT1(+KTS)和WT1(-KTS)过表达载体构建 20 3.3 WT1(+KTS)和WT1(-KTS)过表达效率检测 20 I 华中农业大学2020 届硕士研究生学位（毕业）论文 3.4 FSH 对颗粒细胞孕酮合成的影响21 3.5 WT1(+KTS)和WT1(-KTS)对颗粒细胞孕酮合成的影响22 3.6 WT1(+KTS)和WT1(-KTS)对FSHR 和类固醇合成基因的影响22 3.7 WT1(+KTS) 和WT1(-KTS)对ERK1/2 信号通路的影响23 3.8 U0126 和WT1(+/-KTS)对CREB 蛋白表达的影响25 4 讨论26 4.1 WT1 在鸡卵泡颗粒细胞中表达差异26 4.2 WT1 对颗粒细胞孕酮合成的影响26 4.3 鸡WT1 对ERK1/2 信号通路的影响27 5 小结29 5.1 本研究的主要结果29 5.2 结论29 5.3 本研究的创新点30 5.4 本研究的不足之处30 5.5 本研究的下一步计划30 参考文献31 附录31 致谢40 II WT1 对鸡排卵前颗粒细胞孕酮合成的影响 摘要 WT1 基因编码一个含有四个锌指结构的转录因子，在多种动物组织和器官中表 达并起到至关重要的作用，它不仅能调控肿瘤发生，也能调控组织或器官的生长发 育。WT1 存在WT1(+KTS)和WT1(-KTS)两种可变剪切体，在不同细胞或不同发育 阶段能执行不同的生理功能。孕酮 （P4 ）由颗粒细胞合成，参与卵巢发育的多种生 理过程，对维持雌性动物正常的繁殖具有重要的作用，但WT1(+/-KTS)对鸡颗粒细 胞孕酮合成的调控作用尚不十分清楚。本研究旨在研究 WT1(+/-KTS)对鸡排卵前颗 粒细胞孕酮合成的影响。利用实时荧光定量技术 （RT-qPCR ）检测