黑水虻金属硫蛋白基因的鉴定及功能研究.pdfVIP

黑水虻金属硫蛋白基因的鉴定及功能研究 目录 摘要 i Abstract ii 1 前言 1 1.1 研究问题的由来 1 1.2 文献综述 1 1.2.1 重金属污染的现状 1 1.2.2 重金属污染的危害 2 1.2.3 重金属污染的治理 2 1.2.4 昆虫对重金属的耐受及在重金属污染治理中的应用 3 1.2.4 MT 基因在昆虫耐受重金属中的作用 5 1.3 研究目的与意义 6 1.4 技术路线 7 2 材料与方法 8 2.1 供试昆虫 8 2.2 主要试剂 8 2.3 主要仪器 8 2.4 供试方法 9 2.4.1 黑水虻内参基因稳定性评价 9 2.4.2 黑水虻MT 基因序列克隆与分析 13 2.4.3 黑水虻MT 基因表达模式分析 15 2.4.4 黑水虻MT 原核表达及功能分析 15 2.4.5 黑水虻幼虫MT 基因的干扰 19 2.4.6 数据分析 21 3 结果与分析 21 3.1 黑水虻内参基因稳定性评价 21 3.1.1 候选内参基因表达分析 21 3.1.2 候选内参基因的稳定性分析 22 3.1.3 最佳的内参基因数量 27 I 华中农业大学2020 届硕士研究生学位（毕业）论文 3.1.4 内参基因稳定性验证28 3.2 黑水虻MT 基因序列克隆与分析29 3.3 黑水虻MT 基因表达模式分析34 3.3.1 黑水虻MT 基因的时空表达模式分析34 3.3.2 不同Cd 浓度下黑水虻MT 基因的表达分析37 3.4 黑水虻MT 原核表达及功能分析37 3.4.1 黑水虻MT 重组质粒的构建37 3.4.2 重组质粒对Cd 的耐受性和吸附能力39 3.5 黑水虻幼虫MT 基因的干扰42 3.5.1 干扰黑水虻幼虫MT 基因42 3.5.2 黑水虻幼虫MT 基因沉默后的Cd 耐受力42 4 讨论42 4.1 黑水虻内参基因稳定性评价42 4.2 黑水虻MT 基因序列克隆与分析44 4.3 黑水虻MT 基因表达模式分析45 4.4 黑水虻MT 原核表达及功能分析46 4.5 黑水虻幼虫MT 基因的干扰47 参考文献48 致谢66 II 黑水虻金属硫蛋白基因的鉴定及功能研究 摘要 黑水虻Hermetia illucens 幼虫是重要的资源昆虫。一方面幼虫可以转化多种有机 废弃物，另一方面幼虫富含脂质和蛋白质，可用作畜禽养殖和水产养殖的优质饲料。 近年来研究发现黑水虻幼虫可以在高浓度的重金属环境中存活，因而可利用黑水虻 来处理重金属污染的有机废弃物，如畜禽养殖场的粪便、重金属污染农田的农作物 秸秆。有关黑水虻对重金属耐受性，人们已表征了其生物学参数，但分子机制还不 清楚。本研究拟从金属硫蛋白基因的角度出发，探究其在黑水虻重金属耐受性中的 作用。主要结果如下： 1. 黑水虻内参基因稳定性评价 不同条件下内参基因的稳定性排序结果不同，在不同组织条件下EF1 和Actin 的 稳定性最佳；不同发育阶段应选用Actin 和RPL8 ；不同性别应选用Tubulin 和RPL8 。 通过综合6 个条件下的内参基因表达情况及RefFin