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克氏原螯虾源维氏气单胞菌的鉴定、致病性研究及抗菌中草药筛选 目 录 摘 要 i Abstract iii 第一章 文献综述1 1 克氏原螯虾养殖常见疾病1 1.1 病毒性疾病1 1.2 真菌性疾病2 1.3 细菌性疾病2 2 维氏气单胞菌的研究进展3 2.1 分类及地位3 2.2 维氏气单胞菌的生物学特征3 2.3 维氏气单胞菌的鉴定方法4 2.4 维氏气单胞菌的致病性5 2.5 维氏气单胞菌的毒力因子6 2.6 维氏气单胞菌的基因分型研究7 3 中草药抗菌研究进展8 3.1 中草药抗菌药物筛选8 3.2 中草药抗菌机理研究9 3.3 中草药制剂在虾蟹养殖中应用9 4 本研究内容及目的意义10 第二章 克氏原螯虾源维氏气单胞菌的分离鉴定和分型研究11 1 材料和方法11 1.1 样品的收集和处理11 1.2 主要试剂11 1.3 主要仪器11 1.4 病原的分离和纯化12 1.5 回归感染实验12 1.6 表型鉴定13 1.7 16Sr DNA 和gyrb 基因的PCR 鉴定及其系统发育分析13 1.8 药物敏感性实验14 Ⅰ 华中农业大学2020 届硕士研究生学位论文 1.9 毒力基因的检测14 1.10 菌株MLST 分型15 2 结果与分析17 2.1 患病虾症状和分离菌观察17 2.2 生理生化特征17 2.3 致病性试验18 2.4 16S rDNA 和gyrB 鉴定及其系统发育分析19 2.5 病原菌的药敏性20 2.6 MLST 分型22 2.7 毒力基因检测结果23 3 讨论23 第三章 维氏气单胞菌感染克氏原螯虾的组织病理学研究26 1 材料和方法26 1.1 主要试剂26 1.2 主要仪器26 1.3 样品的收集和处理26 1.4 组织病理切片制作26 2 结果与分析27 3 讨论30 第四章 中草药对维氏气单胞菌体外抑菌实验32 1 材料与方法32 1.1 主要试剂32 1.2 主要仪器32 1.3 中草药浓缩药液的制备32 1.4 维氏气单胞菌菌悬液的制备33 1.5 药物敏感性试验33 1.6 中草药最小抑菌浓度和最低杀菌浓度的测定33 2 结果与分析34 2.1 药液抑菌圈直径的测定结果34 2.2 中草药药液体外MIC 与MBC 测定结果36 Ⅱ 华中农业大学2020 届硕士研究生学位论文 3 讨论37 参考文献38 附录49 致谢50 Ⅲ 克氏原螯虾源维氏气单胞菌的鉴定、致病性研究及抗菌中草药筛选 摘 要 随着克氏原螯虾养殖业的迅猛发展，其病害越来越严重，病害已经成为制 约克氏原螯虾产业健康发展的重要因素。2016 年 5 月，湖北省潜江市某克氏原 螯虾养殖场出现克氏原螯虾暴发性死亡现象，造成了严重的经济损失。患病虾 四肢无力，反应迟钝，应激能力较弱，伏于池塘边沿或水草上陆续死亡。为厘 清病因，本研究对患病虾进行了病