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孔隙结构中生物膜的形成及群落组装 目 录 摘要i Abstractiii 1 前言1 1.1 生物膜2 1.1.1 生物膜研究历史及定义2 1.1.2 生物膜形成过程2 1.1.3 生物膜基质及其功能3 1.1.4 生物膜中细菌互作及群落演替5 1.2 土壤生物膜群落功能及重要性7 1.3 微流控技术8 1.3.1 微流控技术起源与优势8 1.3.2 微流控技术应用于环境研究的可行性9 1.3.3 微流控技术在细菌研究中的应用11 1.4 研究意义及内容12 2 材料与方法13 2.1 实验材料13 2.1.1 实验土壤13 2.1.2Nycodenz 试剂13 2.1.3 缓冲液14 2.1.4 土壤浸提液14 2.1.5 培养基14 2.1.6 土壤微生物群落提取15 2.2 微流控芯片制备15 2.2.1 微流控芯片设计15 2.2.2 微流控芯片制作过程16 2.3 微流控培养系统构建18 2.4 稻田土壤混合细菌接种前处理18 2.5 激光共聚焦显微镜观察19 I 华中农业大学2020 届硕士研究生学位论文 2.6 土壤生物膜EPS组分观测19 2.7 显微镜图像定量19 2.8 高通量土壤生物膜培养20 2.9 16SrRNA 基因高通量测序21 2.10 生物信息学分析21 2.11 数据分析22 3 结果22 3.1 微流控芯片验证22 3.2 土壤生物膜形貌结构变化23 3.3 土壤生物膜EPS组分含量变化24 3.5 高通量测序文库信息28 3.6Alpha 多样性分析29 3.7 门水平上细菌群落组成及多样性30 3.8 纲目科属水平上细菌群落组成及多样性31 3.9 不同培养时间下细菌丰富度34 4 讨论35 4.1 孔隙结构中土壤生物膜形貌结构变化35 4.2 孔隙结构中土壤生物膜EPS组分动态变化36 4.3 孔隙结构中土壤生物膜细菌群落组装37 5 结论38 参考文献39 致谢49 II 孔隙结构中生物膜的形成及群落组装 摘要 地球上绝大多数微生物以生物膜形式存在，它们附着在固相颗粒、植物根际、 海洋沉积物等表面。土壤中微生物丰度高，是生物膜形成的潜在区域，土壤生物膜 在作物生产、土壤改良、环境保护等方面表现出巨大潜力。然而自然土壤成分复杂， 异质性高，这对开展土壤生物膜研究造成了诸多挑战。在本研究中，设计了微流控 芯片以模拟土壤物理孔隙结构，其中以50 µm 直径大小的微柱代表土壤颗粒，借助 激光共聚焦显微镜、荧光染色技术、数字图像分析技术，研究了土壤生物膜形貌及 EPS 16SrRNA 胞外聚合物 （ ）组分的动态变化过程；结合 测序技术、生物信息学分 析方法，获取了培养过程中土壤生物膜群落变化规律等信息。主要研究结果如下： 激光共聚焦显微镜观测结果表明，土壤生物膜形成过程包括四个阶段，分别是