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利用生物技术改良油菜种子芥酸、油酸和α-亚麻酸组成 目录 摘要i Abstract ii 缩略语表iv 1 前言 1 1.1 问题的由来 1 1.2 文献综述2 1.2.1 国内外油菜产业发展概况2 1.2.2 脂肪酸的生物合成4 1.2.3 脂肪酸改良育种6 低芥酸育种及研究进展6 高芥酸育种及研究进展7 高油酸育种及研究进展9 高α-亚麻酸育种及研究进展 11 1.2.4 CRISPR-Cas9 技术及在作物中的应用 12 1.3 研究目的及意义 14 2 实验材料与方法 16 2.1 实验材料 16 2.1.1 植物材料 16 2.1.2 菌株及载体 16 2.2 技术路线 17 2.3 实验方法 17 2.3.1 目的基因序列查找和基因克隆引物设计 17 2.3.2 发育中种子RNA 抽提 17 2.3.3 RT-PCR 制备cDNA 18 2.3.4 目的基因克隆 18 2.3.5 种子特异性表达载体构建 19 2.3.6 CRISPR-Cas9 载体构建20 2.3.7 油菜遗传转化21 I 华中农业大学2020 届硕士研究生学位（毕业）论文 2.3.8 CTAB 法抽提植物基因组DNA 22 2.3.9 qRT-PCR 检测基因表达量22 2.3.10 CRISPR 材料的鉴定23 2.3.11 脂质提取和分析23 2.3.12 数据分析与制图24 3 结果与分析25 3.1 载体构建25 3.1.1 CRISPR 靶点设计及其在野生型材料中的测序25 3.1.2 CsFAD2 和CsFAD3 的克隆27 3.2 油菜遗传转化27 3.3 CsFAD2 和CsFAD3 在转基因油菜发育种子中的表达分析29 3.4 CsFAD2 和CsFAD3 的基因聚合30 3.5 转基因种子中的脂肪酸组成和含油量分析31 3.5.1 利用CRISPR-Cas9 敲除BnFAE1 降低油菜种子中的芥酸含量31 3.5.2 利用CRISPR-Cas9 敲除BnFAD2 提高油菜种子中的芥酸含量35 3.5.3 利用CRISPR-Cas9 敲除BnFAD2 提高油菜种子中的油酸含量38 3.5.4 过表达CsFAD2 或CsFAD3 提高油菜种子中的α-亚麻酸含量39 3.5.5 聚合CsFAD2 和CsFAD3 提高油菜种子中的α-亚麻酸含量40 3.6 筛选无外源DNA 的单株42 4 讨论44 4.1 敲除BnFAE1 对油菜脂肪酸组成和含油量的影响44 4.2 敲除BnFAD2 对油菜脂肪酸组成和含油量的影响45 4.3 过表达CsFAD2/CsFAD3 对油菜脂肪酸组成和含油量的影响46 4.4 创新与不足48 4.5 展望48 参考文献49 附录60 致谢65 II 利用生物技术改良油菜种子芥酸、油酸和α-亚麻酸组成 摘要 油