大肠杆菌高效表达重组蛋白策略.pdfVIP

大肠杆菌高效表达重组蛋白策略 前言 重组蛋白的制备在蛋白结构分析和医疗应用领域十分重要。药物蛋白的研究 [1] 需要高纯度的重组蛋白来进行药物动力学和物理化学的研究 。重组蛋白在检测 酶活、连接配体、蛋白相互作用等生物学领域广泛应用。已经表达出多种重组蛋 [2,3] 白被证明有很大的应用潜力 。通过基因工程改造的方法已经获得了许多性状 优良的宿主菌表达系统，尤其是通过大肠杆菌可以大量表达外源基因编码的重组 [4] 蛋白 。但是仍然有两个问题制约着大肠杆菌表达系统对重组蛋白的表达：一个 [5] 是表达量低，还有一个就是表达错误折叠的蛋白包涵体 。蛋白的表达和纯化工 艺一直在发展进步，但是超过 30%的重组蛋白为不具有生物活性的包涵体，严重 影响了重组蛋白的生产应用[6,7] 。 在理想条件下，重组蛋白由强启动子进行表达，产生大量的具有生物学活性 的可溶性重组蛋白。但是，强启动子会导致重组蛋白的过表达,从而影响宿主菌 [8] 体的生长并产生包涵体 。在某些条件下可以通过变性、复性的方法使包涵体恢 [9] 复活性 ，但是复性后的蛋白是否能够完全恢复活性仍然未可知。一般来讲，可 以通过表达条件的优化来促进蛋白的可溶性表达，比如：诱导温度、培养基组成、 宿主菌的种类。还可以通过多种方案来解决蛋白不溶的问题：蛋白重新折叠[10] ， [11] [8] 构建融合蛋白 。另外想要进一步增加蛋白可溶性可以与分子伴侣共表达 或者 [12] 低温诱导 。本文对目前主要的促进蛋白可溶表达的方法进行了比较全面的总结。 1.大肠杆菌表达系统的构建 1.1 选择表达宿主菌 对于大规模的表达重组蛋白，一般选择胞内表达或者周质空间表达。与周质 空间表达相比，胞内表达的表达量更高，因此应用更为广泛。在实验研究和实际 生产中，已经有很多大肠杆菌表达系统广泛应用于。在表达体系中较为常用的大 肠杆菌为 B 菌株和 K12 菌株及它们的衍生菌株（表 1[13] ）。美国国立研究院已经 认证了 K12 菌株的标准性以及安全的使用方案，因此 K12 菌株在生产应用中具有 极大的优势。但是由 B 菌株演变而来的 BL 系列菌株与 K12 相比，突变了 lon 和 ompT 两个基因[14] ，因此具有许多表达优势：产物积累少，缺少蛋白酶，防止产 物被降解。这些优势使得 BL 菌株也具有非常广泛的应用[15,16,17] 。 通常来讲，针对不同的重组蛋白，宿主菌的选择也是不同的。如果重组蛋白 含有大肠杆菌稀有密码子，就需要宿主能够表达针对这些密码子的 tRNA ，比如 BL21 (DE3) CodonPlus-RIL ，Rosetta (DE3)等菌株。如果重组蛋白具有许多二硫 键，则需要宿主表达环境为氧化条件的。AD494 宿主菌是硫氧还蛋白突变型， 可以促进二硫键的折叠。Origami 菌株为硫氧还蛋白突变和谷胱甘肽还原酶突变， 进一步加强了二硫键在细胞内的形成[18] 。另外一方面，如果表达的重组蛋白对 于宿主菌是有毒性的，则需要表达为包涵体的形式。 表 1：常用于重组蛋白表达的宿主菌及其特点 1.2 质粒的设计 理想的基因转录是质粒和启动子功能协同完成的。广泛使用的质粒都是由复 制子、启动子、标记位点、多克隆位点、融合蛋白联合调控进行转录的（图 1[20] 。） 重组蛋白的表达量与质粒的拷贝数、结构、分离稳定性有关。如果拷贝数低形成 的mRNA 数量少，蛋白的表达量就会降低。高拷贝数可以提高蛋白的表达量， 但是这也会给宿主造成代谢上的负担。拷贝数很大程度上由起始子的复制情况决 定的，也体现出质粒是严密调控还是松散调控。 图 1. 质粒的基本构成 高拷贝数质