载体构建的基本步骤..pdfVIP

载体构建 一、原理 依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用， 分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连 接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正 确表达。 二、操作步骤 1、摇菌 （制作感受态细胞备用） 取装有液体培养基的3ml试管两支 （依情况而定），每管加40-100μl 菌种，过夜摇。 2、提质粒 （也就是载体） 依照提质粒试剂盒中的说明书操作 （根据情况最后一步洗脱时可以多 洗1-2次）。 3、酶切 （双酶切产生粘性末端） 反应所需试剂 体积 （单位：ul） 质粒 10 所需内切酶反应缓冲液 2 所需限制性内切核酸酶 1 H O 7 2 将加好的EP管置于37℃保温1-2h。 （依照提酶切的具体步骤操作；为 了达到最佳酶切的效果，最好根据所选用的酶确定所需要的反应温度） 4、电泳检测 将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测酶切是否成功。 回收胶：琼脂糖与缓冲液一比一制胶，经过切胶回收目的产物，也有目 的产物纯化的功能； 检测胶：琼脂糖与缓冲液一比二制胶，为了检测目的条带与预期是否相 符。 切胶回收与产物纯化是差不多的过程，所达到的目的是一样的：切胶 回收也是一种纯化过程，它能去除非目的片段，然后用回收试剂盒进行 纯化，能将很不纯的DNA溶液纯化；产物纯化是将较纯的DNA溶液进 一步除去多余的杂质，用纯化试剂盒，你会发现纯化试剂盒和回收试剂 盒的步骤几乎一样。 5、载体与目的基因连接 如果电泳检测酶切成功的话，则仔细将所需的片段切割下来，将胶 体回收 （依照胶回收试剂盒说明书操作）；之后将回收的片段和载体连 接。置于温箱，12-16℃，保温8-16h 6、转化 （连接产物转化到感受态细胞中） 依照转化具体操作步骤做感受态，将上述连接产物进行转化实验，涂 板培养，37℃， 12-16h。 7、单克隆检测 （1）挑单克隆 先将AMP从冰箱中取出，待融化后，在3ml装有LB液体培养基的试管中 加入3μL的 AMP，用枪头混匀；取1.5 mlEP管5支 （依情况可以多挑几管），给每支 管中加500μL上述培养液，然后用接种环 （或黄枪头）挑单克隆，挑完 后用枪吹打；之后，将挑好的菌摇4-5小时，至混浊即可。 （2 ）单克隆检测 以每管摇好的菌液为模板，以原有的引物进行PCR，然后将PCR产物跑电 泳，观察电泳图像中那几管的条带正确，将正确条带相对应管的菌液再 + 抽取100μL，加到3ml （有LB液体培养液，AMP ）试管中，过夜摇；第 二天重摇，将摇好的菌取1ml于1.5mlEP管中送测序，并保种。 注：①挑单克隆时，一定要挑单一圆润的菌落，有卫星斑的不挑。 ②别忘记往培养基中加AMP。 3 用接种环挑菌后，要在酒精灯上反复灼烧，然后再进行下 一次挑菌。 三、注意事项 1． 连接产物可短时间在-20 ℃保存，使用时可以取出进行后续实 验； 2 ． 在细胞转化时，冰浴和热激要严格控制好时间； 3 ． 连接反应是DNA重组过程中的关键步骤，其成败的重要参数之一 就是温度，因此要控 制好连接温度。 4 ．进行黏末端连接时，会产生一定数量的载体自身环化分子，导致转 化菌中过高的假阳性克隆背景。针对这一问题，常采用牛小肠碱性磷酸 酶 （CIP）去掉载体的5’-磷酸以抑制DNA片段的自身环化。