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作 业 指 导 书 无菌试验 操作细则 编 号 - -2006 版 本 号 第一版 生效日期 起 草 审 核 批 准 一 范围： 适用于本规程规定的医疗用品的无菌试验方法。无菌检查法系用于检查要求无菌的医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。 本试验系将医疗器械或其浸提液接种于培养基内， 以检验供试品是否有细菌和真 菌污染。 二 依据： GB/T14233.2-2005 医用输液、输血、注射器具检验方法。第二部份：生物试验方 法。 中华人民共和国药典 2005 年版 二部 三 器具及试剂 3.1.器材 3.1.1 仪器超净工作台  光学显微镜  恒温培养箱  生化培养箱  压力蒸汽灭菌器 3.1.2 用具 试管 注射器 量筒 三角烧瓶 锥形瓶 移液管 灭菌刻度吸管（ 1ml） 灭菌平皿 （ 9cm） 酒精灯 75℅乙醇棉 灭菌的剪刀和镊子 精密 PH试纸 灭菌袋或牛皮纸 3.2 培养基及制备方法 硫乙醇酸盐流体培养基置 30～35℃培养 ; 改良马丁培养基置 20～ 25℃培养。 培养基可按以下处方制备， 亦可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。  配制后应采 用验证合格的灭菌程序灭菌。制备好的培养基应保存在 2～25℃、避光的环境。培养基若 保存于非密闭容器中，应在三周内使用；若保存于密闭容器中，可在一年内使用。 A).硫乙醇酸盐流体培养基（用于培养需气菌、厌气菌） 酪胨 (胰酶水解 ) 15.0g 酵母浸出粉 5.0g 葡萄糖 5.0g 氯化钠 2.5g L- 胱氨酸 0.5g 新配制的 0.1%刃天青溶液 1.0ml 硫乙醇酸钠 0.5g 琼脂 0.5～0.7g (或硫乙醇酸 0.3ml) 蒸馏水 1000ml 除葡萄糖和刃天青溶液外， 取上述成分加入蒸馏水中混合， 微温溶解， 调节 pH 为弱碱性， 煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节 pH 值使灭菌后为 7.1± 0.2。分装至 适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超 过培养基深度的 1/2。灭菌。在供试品接种前，培养基氧化层的颜色不得超过培养基深度 的 1/3，否则，须经 100℃水浴加热至粉红色消失（不超过 20 分钟），迅速冷却，只限加 热一次，并防止被污染。 第 1 页 B).改良马丁培养基（用于培养真菌） 蛋白胨 5.0g 磷酸氢二钾 1.0g 酵母浸出粉 2.0g 硫酸镁 0.5g 葡萄糖 20.0g 蒸馏水 1000ml 除葡萄糖外， 取上述成分加入蒸馏水内混合， 微温溶解， 调节 pH 值约为 6.8，煮沸，加入 葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节 pH 值使灭菌后为 6.4± 0.2，分装，灭菌。 C）.营养琼脂培养基 蛋白胨 10.0g 氯化钠 5.0g  牛肉浸出粉 3g  15～20g 琼脂  蒸馏水 1000ml 取上述成份混合，微温溶解，调节 pH 为弱碱性，煮沸，滤清，调节 pH 值使灭菌后为 7.2 ± 0.2，分装，灭菌。 3.3 稀释液、冲洗液及其制备方法 1、质量浓度为 9g/L 的无菌氯化钠溶液 2、0.1％蛋白胨水溶液 取蛋白胨 1.0g，加水 1000ml，微温溶解，滤清，调节 pH 值至 7.1± 0.2，分装，灭菌。 3、pH7.0 氯化钠 -蛋白胨缓冲液  取磷酸二氢钾 3.56g、磷酸氢二钠 7.23g、氯化钠 4.30g、蛋白胨 1.0g，加水 1000ml，微温溶解，滤清，分装，灭菌。 4.1 实验前准备： 4.1.1 培养基要求： 用于培养需（厌）气菌和真菌的培养基的制备、培养基灵敏度检查及其他各 项要求应符合《中国药典（二部） 》附录中《无菌检查法》的规定。 培养基可按药典的处方制备，也可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。制备 后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。 制备好的培养基应保存在 2~ 25℃、避光的环境。 培养基若保存于非密闭容器中，一般在三周内使用 ;若保存于密闭容器中，一般可在 一年内使用。 4.1.2 器具灭菌：与供试液接触的所有器具应采用可靠方法灭菌，置压力蒸气灭菌器内 121℃30min，或置电热干燥箱内 160℃2h。 4.1.3 无菌室要求：无菌室操作台或超净工作台局部应符合洁净度 100 级单向流空气区域 要求。无菌室在消毒处理完毕后，应检查空气中的菌落数，方法如下：取直径约 90mm 培 养皿，无菌操作注入融化的营养琼脂培养基约 20mL，在 30℃～ 35℃培养 48h