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Biochemistry Experiment 7 2020/7/16 31 ① 浓缩效应 1. 缓冲液与凝胶的离子成分和 pH 值不同。 Cl - ， Gly - ，蛋白 质离子。快慢离子迁移快慢 的差别造成电场强度与电导 率的变化。低导电区和高导 电区。蛋白质样品迁移率在 快慢离子之间，压缩聚集成 一条窄带。 2. 两层凝胶的孔径不同：浓缩胶 为大孔胶，分离胶为小孔胶 Biochemistry Experiment 7 2020/7/16 32 ②分子筛效应 移动界面到达浓缩胶和 分离胶界面时，凝胶的 pH 变 化明显，缓冲液中甘氨酸的 解离迅速增加，直至完全解 离出 gly-, 其分子量小，迁移 超过蛋白质分子。而丧失夹 击的作用；同时，凝胶的孔 径变小，降低了蛋白质的迁 移率。故蛋白质分子在均一 的电压梯度和 pH 值中泳动， 依其分子量的大小而分开。 工程菌中 GST 酶的亲和层析分离 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳 （ SDS）鉴定 蛋白质分离纯化综合实验 Biochemistry Experiment 7 2020/7/16 2 Contents 1. 蛋白质分离纯化 2. 蛋白质的鉴定分析 Biochemistry Experiment 7 2020/7/16 3 ? 根据蛋白分子特异性的差异，如分子大小，溶解度，电荷等 建立起来的。 性 质 方 法 ? 分子大小 透析、超滤、密度梯度离心、凝胶过滤 ? 溶解度 等电点沉淀、盐析、有机溶剂沉淀 ? 电荷 电泳、离子交换层析 ? 吸附性质 吸附层析 ( 羟基磷灰石层析、疏水作用层析 ) ? 对配体分子 亲和层析 的生物亲和力 蛋白质分离纯化的方法 Biochemistry Experiment 7 2020/7/16 4 等电点沉淀法 聚乙二醇沉淀法 盐析法 有机溶剂沉淀法 热变性沉淀法 蛋白质分离纯化 1 ．电泳法 2 ．层析法 3 ．沉淀法 4 ． 透析、超滤 5 、离心 6 、结晶 Biochemistry Experiment 7 2020/7/16 5 ? 主要是利用 盐析法、等电点沉淀、有机溶剂 沉淀 等方法，使目的蛋白与其它较大量的杂 蛋白分开，这些方法的特点是简便、处理量 大、既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质， 但分辨率低。 一、粗分级分离 Biochemistry Experiment 7 2020/7/16 6 （ 1 ）盐析 (Salting-out) ? 向蛋白质溶液中加入大量的中性盐 [(NH 4 ) 2 SO 4 ， Na 2 SO 4 ， NaCl 等 ] ，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。常用的盐 析剂是硫酸铵，其盐析能力强，水中溶解度大，浓度 高时也不会引起蛋白质活性丧失。 ? 盐析作用是由于当盐浓度较高时，盐离子与水分子作用，使 水的活度降低，原来溶液中大部分的自由水转变为盐离子的水 化水，从而降低蛋白质极性基团与水分子之间的作用，破坏蛋 白质分子表面的水化层。 ? 盐析沉淀的蛋白质仍保持天然构象，即仍有活性。 Biochemistry Experiment 7 2020/7/16 7 Biochemistry Experiment 7 2020/7/16 8 ? 蛋白质用盐析方法沉淀分离后，还需要脱盐才能 进一步精提纯。脱盐常选用 透析法 或 凝胶过滤 。 透析 是将含有小分子杂质的 蛋白质溶液装在半透膜（玻璃 纸、火绵纸等）制的透析袋里 放在蒸馏水 ( 缓冲液 ) 中进行， 可不断更换蒸馏水，直至杂质 被除去。 透析袋 蛋白质溶液 蒸馏水 （ 2 ）透析 (Dialysis) Biochemistry Experiment 7 2020/7/16 9 （ 3 ）等电点沉淀 ? 蛋白质是两性电解质，其溶解度与其净电荷数量 有关，随溶液 pH 变化而变化。在溶液 pH 值等于 蛋白质等电点时，蛋白质的溶解度最小。 ? 不同的蛋白质有不同的等电点，因此通过 调节溶 液 pH 到目的蛋白的等电点，可使之沉淀而与其它 蛋白质分开，从而除去大量杂蛋白。 Biochemistry Experiment 7 2020/7/16 10 (4) 有机溶剂法 ? 与水互溶的极性 有机溶剂 如甲醇、乙醇、丙酮等能使蛋白质在 水中的溶解度显著降低。 ? 有机溶剂引起蛋白质变性的原因有二： ? 降低水的介电常数，使蛋白质分子表面可解离基团的离子化程度减弱，水化 程度降低，促进了蛋白质分子的聚集沉淀。 ? 极性有机溶剂与蛋白质争夺水化水，而使蛋白质分子沉淀。 ? 室温下，有机溶剂不仅能使蛋白质沉淀，而且伴随着变性。可在不断搅拌下 将预冷的有机溶剂逐渐加入蛋白质溶液中，防止有机溶剂局部浓度过高，则 在很大程度上解决变性问题。 ? 不同的蛋白质由于水化层