饲喂ob基因重组酵母对小鼠瘦素的调节研究.pdfVIP

摘要 摘要 随着肥胖患者的急剧增多，与之相关的 2 型糖尿病、动脉粥样硬化、心血管疾病 以及癌症等疾病患者不断增加，这也使得肥胖成为覆盖全球的重大健康难题。研究表 明，肥胖的产生与肥胖基因（ob ）编码的瘦素蛋白 （leptin ）水平的失控有着密不可分 的关系。瘦素的主要生理作用是控制食物摄入，增加机体能量消耗。鉴于此研究，开 始探索利用瘦素治疗肥胖的可能性，然而瘦素抵抗现象的存在使得瘦素在临床治疗中 并没有效果，只对少部分基因突变的缺乏瘦素的肥胖个体有效果。而新的研究也提供 了新的方向：通过注射中性瘦素抗体能够与血液中的循环瘦素发生免疫反应，瘦素抗 体与血液中的循环瘦素结合，中和抵消血液中的瘦素进而恢复瘦素的敏感性，使得正 常肥胖患者体内的瘦素可以发挥正常的生理功能。 酿酒酵母能够刺激树突状细胞 （DCs ）发生免疫反应，之后围绕着树突状细胞以及 酵母互作开发的免疫疗法逐渐取得世人的关注。从最初的蛋白表达系统到表面展示系 统，再到之后的DNA/mRNA/shRNA 等核酸系统，该系统的免疫效果逐步优化增强。 本研究将ob 基因与重组酵母系统相结合，开发一种针对瘦素调控的ob 基因重组 酵母，并利用活体实验验证了在不同饮食条件 （高脂组、正常组）该ob 基因重组酵母 效果。本文的主要的研究成果如下： 1.构建了两种不同的 ob 基因重组酵母：JMB84-CMV-OVA-ob、JMB84-CMV-ob 。 本研究通过基因克隆等技术，构建了三种不同的真核表达质粒，以及细胞水平上验证 载体JMB84-CMV-OVA-ob-T2A-GFP-polyA 表达盒的成功表达；之后以JMY31 酵母菌 为基础，构建了两种不同ob 基因重组酵母。 2.构建了ob 基因原核表达载体，进行ob 基因的原核诱导表达，并将ob 基因原核 表达的重组瘦素蛋白纯化作为后续抗体检测实验的抗原。 3.在活体水平上对饲喂ob 基因重组酵母进行性能评价。本研究通过饲喂ob 基因重 组酵母在不同的饲养条件下（高脂诱导、正常饮食），利用蛋白免疫印迹试验、酶联免 疫吸附试验等实验方法对不同实验组的瘦素抗体进行验证，筛选出效果较好的重组酵 母；此外，通过实验检测发现，该重组酵母系统能够降低血液中的循环瘦素、总胆固 醇、甘油三酯的水平，同时可以有效地降低实验动物的采食量并减少体重的增加。尤 其是对于高脂饮食诱导的小鼠，饲喂该重组酵母系统后能够有效地降低肝脏组织脂肪 病变中的脂滴的大小。 综上所述，本研究构建了两种针对瘦素调控的重组酵母菌株：JMB84-CMV-OVA-ob 和 JMB84-CMV-ob 。随后利用重组酵母系统实现了对机体瘦素抵抗进行调节，并对两 I 西北农林科技大学硕士学位论文 种不同的重组酵母系统的作用效果进行了评估，筛选出了效果较好的重组酵母系统 JMB84-CMV-OVA-ob ，能够有效地降低血液中的瘦素水平、甘油三酯、总胆固醇、动 物的采食量、减少体重的获得以及有效地降低肝脏组织脂肪病变中的脂滴的大小，这 也为未来利用瘦素抵抗原理治疗肥胖疗法的开发提供了有益的借鉴。 关键词：重组酵母；ob 基因；leptin ；瘦素抵抗；小鼠 II 目录 目录 摘要I ABSTRACT III 目录V 主要符号对照表IX 第一章 文献综述 1 1.1 肥胖基因与瘦素 1 1.1.1 肥胖基因 1 1.1.2 瘦素 1 1.2 leptin 与瘦素受体（LepR ）的基本结构和功能 2 1.2.1 leptin 的基本结构 2 1.2.2 瘦素受体（LepR ）的基本结构 2 1.2.3 leptin 的功能 3