C型钠肽调节小鼠卵母细胞线粒体功能的分子机制研究.pdfVIP

摘 要 C 型钠肽调节小鼠卵母细胞线粒体功能的分子机制研究 摘 要 哺乳动物卵母细胞体外培养时，由于离开了在体卵泡环境，使卵母细胞内的环腺 苷磷酸(cyclic adenosine 3’, 5’- monophosphate, cAMP)水平迅速下降，从而导致卵母细胞 内成熟促进因子(maturation promoting factor, MPF)活性恢复，过早启动减数分裂。减数 分裂的过早启动和完成，使卵母细胞没有足够的时间完成胞质成熟所需要的物质储备， 因而胞质成熟不充分，并导致体外培养的卵母细胞核成熟（减数分裂）和胞质成熟不同 步，获得的卵母细胞的质量低、后续发育能力差。线粒体作为卵母细胞能量产生的主要 中心，通过一系列氧化磷酸化过程为卵母细胞的成熟及其后续发育提供能量。同时，线 粒体与卵母细胞中活性氧(reactive oxygen species, ROS)的生成和消除密切相关，因此在 调控卵母细胞氧化应激中发挥重要作用。已有研究证明，C 型钠肽(C-type natriuretic peptide, CNP) 可通过作用于卵丘细胞鸟苷酸环化酶受体(natriuretic peptide receptor 2, NPR2)维持卵母细胞减数分裂阻滞，从而为胞质成熟赢得了更多的时间，使卵母细胞胞 质能够充分成熟，从而提高卵母细胞质量。其中，CNP 是否通过调节卵母细胞中的线 粒体功能，进而影响到卵母细胞质量，及其调节的机制需要进一步解析。 本研究主要探讨CNP 对小鼠卵母细胞中线粒体形态、分布、氧化代谢的影响及其 对线粒体融合、分裂和氧化代谢相关基因表达的影响，探讨CNP 对小鼠卵母细胞线粒 体生理状态的影响及其调控机制。研究内容和研究结果如下： (1) 选择发情前期小鼠，腹腔注射孕马血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin, PMSG)促进卵泡发育，PMSG 处理24 h 后处死小鼠、采集卵巢，分离小鼠 卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes, COCs)进行COCs 体外培养。在培养的 1 h, 2 h, 3 h 和4 h 时，回收培养的COCs 进行GVBD 检测，结果发现小鼠COCs 在基础 培养液培养2 h 前后卵母细胞迅速发生生发泡破裂(germinal vesicle break down, GVBD)， GVBD 发生率为53.42 ± 10.53 %，到4 h 时GVBD 发生率达到85.86 ± 3.80 %，所以选 择培养2 h 作为后续卵母细胞线粒体氧化代谢、数量分布等研究工作的检测时间点。 (2) 为了检测 CNP 对小鼠卵母细胞体外培养过程中线粒体氧化代谢的影响，将 COCs 分为两组，即对照组（基础培养液组）和根据实验室前期研究结果设计的CNP 处 理组 （添加50 nM CNP 的培养液组）中培养2 h 。培养结束后，脱去卵丘细胞，利用相 关荧光探针、试剂盒检测卵母细胞中的活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平、还原 型谷胱甘肽(glutathione, GSH)含量和线粒体膜电位水平。结果表明，CNP 处理组卵母细 I 摘 要 胞中的ROS 含量显著低于对照组(P 0.05)，GSH 含量和线粒体膜电位水平显著高于对 照组(P 0.05) 。说明经CNP 处理降低了小鼠卵母细胞ROS 水平，提升了抗氧化应激 能力（谷胱甘肽水平升高）和线粒体活性（膜电位水平升高）。 (3) 为了检测CNP 对小鼠卵母细胞体外培养过程中线粒体分布和数量的影响，对 卵母细胞的线粒体和核进行染色，以确定卵母细胞中线粒体形态和分布；提取两组的 小鼠卵母细胞中的线粒体DNA ，采用qRT-PCR 技术检测卵母细胞线粒体拷贝数。结 果表明，CNP 处理2 h 后，小鼠卵母细胞线粒体呈核周分布，同时在核周有小的簇状 聚集，而对照组卵母细胞中的线粒体颗粒小，并均匀分布于胞质中；CNP 处理组卵母 细胞中的线粒体拷贝数显著高于对照组(P 0.05) 。可以看出，CNP 处理的小鼠卵母细 胞中的线