第十节谷胱甘肽过氧化物酶GSHPx活力测定参考资料.docxVIP

羅 1.3.6.2 血或组织中谷胱甘肽过氧化物酶（ GSH－ Px）活力测定 蒅 1.3.6.2.1 原理 薁谷胱甘肽过氧化物酶（ GSH-Px ）是体内存在的一种含硒清除自由基和抑制自由基反应 的系统。对防止体内自由基引起膜脂质过氧化特别重要，其活力以催化 GSH 氧化的反应速 度，及单位时间内 GSH 减少的量来表示， GSH 和 5,5’-二硫对硝基苯甲酸（ DTNB ）反应在 GSH-Px 催化下可生成黄色的 5-硫代 2-硝基苯甲酸阴离子，于 423nm 波长有最大吸收峰， 测定该离子浓度， 即可计算出 GSH 减少的量， 由于 GSH 能进行非酶反应氧化， 所以最后计 算酶活力时，必须扣除非酶反应所引起的 GSH 减少。 聿 1.3.6.2.2 试剂和仪器 莈仪器：可见光分光光度计、酶标仪、低温高速离心机、匀浆器、恒温水浴锅、微量加 样器 袄 试剂：叠氮钠磷酸缓冲液 pH7.0 芁 NaN3 肁 16.25mg 蒆 终浓度 2.5mmol/L 莄 EDTA-N a2 羂 7.44mg 袈终浓度 0.2mmol/L 衿 Na2HPO4 螃 1.732g 螂 终浓度 0.2mol/L 罿 NaH2PO4 羇 1.076g 膃终浓度 0.2mol/L 蒃加蒸馏水至 100mL ，用少量 HCL 、 NaOH 调 pH7.0， 4℃保存。 羁 1mmol/L 谷胱甘肽（还原型 GSH）溶液 肅 GSH 30.7mg 加叠氮钠磷酸缓冲液至 100mL ，临用前配制，冰冻保存 1－ 2 日。 袆 1.25－ 1.5mmol/LH 2O2 溶液 芃 取 30％ H2O2 0.15 －0.17mL ，用双蒸水稀释至 100mL ，作为贮备液， 4℃避光保存，临用 前将贮备液用双蒸水稀释 10 倍即可。 螈偏磷酸沉淀液 蒈 HPO 3 芅 16.7g（先用蒸馏水溶解） 羃 EDTA 袀 0.5g 薆 N aCl 螅 280g 蒀加蒸馏水至 1000mL ，用普通滤纸过滤，室温保存。 羁 0.32mol/LN a2HPO 4 溶液 : 羈 Na2HPO4 22.7g 加蒸馏水至 500mL ，室温保存。 膄 DTNB 显色液 膀 DTNB 蚈 40mg 肇柠檬酸三钠 薃 1.0g 羀加蒸馏水至 100mL ，4℃避光保存 1 个月。 螀 0.2M 磷酸缓冲液 pH7.4 膅 0.9% 生理盐水 羃 1.3.6.2.3 实验步骤 蚁 1.3.6.2.3.1 样品制备 袁溶血液：取鼠血 10μl 加入到 1mL 双蒸水中，充分振摇，使之全部溶血 1:100 内测定酶活力。若当天来不及测定，将肝素抗凝全血置 -20℃冻存， 3d 内测定，若 28h 内必须测完。测前取出样品室温自然解冻。  待测， 4h 4℃存放， 薈组织上清液： 动物禁食过夜， 处死后， 立即取出所需脏器， 放入冷生理盐水中洗去浮血， 剔除脂肪及结缔组织，滤纸吸干后，在冰浴上剪成碎块，称取适量组织，加冷 0.2M 磷酸缓 冲液，以 20000r/min 匀浆 10s，间歇 30s，反复 3 次制成 5%组织匀浆，操作在冰浴中进行，匀浆以 12500× g 离心 10min（低温高速离心机） ，以沉淀为破碎的细胞、细胞碎片、核及线 粒体，上清液用以测胞液中的酶活力，最好当天测，否则加 20％（ v/v ）甘油分装于塑料管， 放置 -20－ -80℃，可保存数周，而酶活力不减。 蒂 1.3.6.2.3.2 GSH 标准曲线的制作： 蒁取 1.0mmol/LGSH 溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL ，分别置于 10mL 小容器瓶中，各加入偏磷酸沉淀剂 8mL ，用双蒸水稀释至 10mL 刻度，即得到浓度为 0、20、 40、60、 80、 100μmol/L 的 GSH 标准液。 蚈取上述不同浓度标准液各 2mL ，放入试管中，加入 0.32mol/L Na 2HPO4 2.5mL ，比色前 加入 DTNB 显色液 0.5mL 用光径 1cm 杯， 5min 内在可见光 423nm 波长测 OD 值，以双蒸水调零点。 蚆以 GSH 含量（ μmol/L ）为横坐标， OD 423 值为纵坐标，绘制标准曲线。 膆 1.3.6.2.3.3 测定步骤： 膂试剂 蚀样品管（ mL ） 肈非酶管（ mL ） 薅空白管（ mL ） 羂 1.0mmol/LGSH 蒇 0.4 膇 0.4 羄 蚂样品** 蕿0.4 芅 莄 莃双蒸水 * 薀 蚇0.4 袃 膃 37℃水浴预温 5min 莇 H2O2（ 37℃预热） 螆 0.2 节 0.2 袃 葿 37℃水浴准确反应 3min （严格控制时间） 肈偏磷酸沉淀液 羆 4 莀 4 薀 芆