2.3.1.2 核酸分子杂交.pdf

核酸分子杂交 LOGO 探针 定义 核酸探针是指能与特定核酸序列发生特异性互补的已知核酸片段。一般而 言，核酸探针带有特殊的标记物。 类型 寡核苷酸探针、基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针、单链DNA探针 探针 探针所携带的标记物应具备的条件 （1 ）标记后的探针的分子结构要尽可能与原来的分子结构相同，绝不影响其碱 基配对特异性，不影响探针分子的主要理化特性，尤其是杂交特性。 （2 ）标记探针的检测方法简便、省时、准确可靠、重复性好、灵敏度高。 （3 ）稳定性好、环境污染少、价廉。 探针 常用的探针标记物 3 32 35 125 （1 ）放射性同位素： H、 P、 S、 I等。 （2 ）非放射性同位素：地高辛素、辣根过氧化酶、碱性磷酸酶等。 探针 常用探针标记法 切口移位(平移)法、引物延伸法、末端标记法 探针 切口移位（平移）法 引物延伸法 探针 末端标记法 dNTPs 探针 核酸分子杂交信号的检测 （1 ）放射性同位素标记探针：放射自显影。 （2 ）非放射性同位素标记探针：偶联反应+显色反应。 预杂交 为了减少探针与广泛存在的非互补核酸的非特异性结合，在杂交前可用封闭 物将这些非特异位点封闭。在杂交前的这些处理过程称为预杂交。 预杂交 常用于预杂交的封闭物 （1 ）变性的非特异性DNA ：常用鲑鱼精子DNA或小牛胸腺DNA。当与滤膜一起孵 育后，除滤膜上已吸附样品DNA的区域外，它们可被吸附到所有其它区域，使整个 背景覆盖一层。由于它们与探针无同源性，在杂交反应中可大大减少探针的非特异 性结合，使背影清晰。 （2 ）高分子化合物：某些高分子化合物具有封闭膜上非特异位点的能力。如聚 乙烯吡咯酮、小牛血清白蛋白、聚蔗糖。