植物原生质体分离和培养技术及制备.pptVIP

影响原生质体融合的因素 原生质体质量至关重要，高质量的原生质体是细胞融合的首要条件。 融合方法 融合参数，包括各种融合液都应选择适当。 植物原生质体的分离与培养技术及制备 酶的种类、组合、浓度 材料 纤维素酶 半纤维素酶 崩溃酶 果胶酶 离析酶 蜗牛酶 研究者 烟草叶片 禾谷类叶片 油菜花粉 马铃薯子叶 马铃薯花粉 1.0 2.0 1.0 1.0 1.0 0.5 1.0 0.1~0.2 0.5 0.5 1.0 Uchimiya Scott 李仕琼 戴朝曦 王蒂 几种草本植物原生质体分离使用的酶种类及浓度(%) 植物原生质体的分离与培养技术及制备 材料 纤维素酶 半纤维素酶 崩溃酶 果胶酶 离析酶 研究者 枸杞愈伤组织 檀香幼叶 檀香愈伤组织 榆幼叶 山毛榉幼叶 胡杨悬浮细胞 0.5 2.0 1.0 0.1~0.2 1.0 0.5 0.5 0.5 0.2 0.5 0.05 0.5 0.5 0.01~0.03 0.1 1.0 0.2 0.5 0.5 孙勇如等 Lakshmi Lakshmi Dorin Ahuja 诸葛强 几种木本植物原生质体分离使用的酶种类及浓度(%) 植物原生质体的分离与培养技术及制备 pH 分离原生质体时，酶液的pH值是值得注意的问题。因为降解酶的活力和细胞活力最适pH值是不一致的。 如制备菜豆叶片原生质体时： 低pH（4.5），酶的活力强，原生质体分离速度快，但细胞活力差，被破坏的细胞较多; pH值偏高（7.0） ，酶活力差，原生质体分离速度慢，完整的原生质体数目较多。 植物原生质体的分离与培养技术及制备 光照和温度 制备原生质体时，在细胞中加入酶液、渗透压稳定剂、质膜稳定剂后，还需在一定时间内保持一定的温度，原生质体方能释放。 脱壁的原生质体对光非常敏感，分离原生质体一般是在黑暗条件下进行的。 在28℃条件下，每分钟40转的旋转式摇床上培养4h后，叶片组织可完全分离 。 悬浮细胞需在25℃～33℃条件下酶解24h 。 植物原生质体的分离与培养技术及制备 渗透压稳定剂 原生质体由于细胞壁的解除和壁压的消失将引起细胞破碎。因而在酶液、原生质体洗涤液、培养液中必须调整渗透压，维持细胞内外渗透压平衡，防止细胞涨破或过分收缩而破坏内部结构。 常用的渗透压稳定剂：甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等，浓度约在0.40M~0.80M。渗透压稳定剂还可促进分离的原生质体再生细胞壁并继续分裂 。 植物原生质体的分离与培养技术及制备 质膜稳定剂 目的：增加完整原生质体的数量，防止质膜破坏，促进原生质体细胞壁再生和细胞分裂形成细胞团。 常用的质膜稳定剂 葡聚糖硫酸钾、2-（N-吗啉）-乙烷磺酸、氯化钙、磷酸二氢钾。 植物原生质体的分离与培养技术及制备 原生质体培养方法 植物原生质体的分离与培养技术及制备 液体浅层培养法 优点： 原生质体在液体环境中有较强的吸收营养物质的能力，表现出较强的细胞分裂能力。操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培养基和转移培养物。 缺点： 原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘连现象而影响其进一步的生长和发育。此外，难以跟踪观察某一个细胞的发育情况。 植物原生质体的分离与培养技术及制备 双层培养法——液体-固体双层培养法 优点： 固体培养基中的营养物质可以缓慢放到液体培养基中，如果在下层固体培养基中添加一定量的活性炭，则还可能吸附培养物产生的一些有害物质，促进原生质体的分裂和细胞团的形成。 缺点： 不易观察细胞的发育过程。 植物原生质体的分离与培养技术及制备 固体薄层培养法 优点： 使原生质体处于固定位置，避免了原生质体的漂浮游动，有利于对单个原生质体的细胞壁再生及细胞团形成的全过程进行定点观察。 缺点： 培养基温度对薄层质量和原生质体分布有一定影响；另外，固体中单细胞生活能力弱，通气状况不良，第一次细胞分裂时间会推迟2d左右。 植物原生质体的分离与培养技术及制备 琼脂糖珠培养 将含有原生质体的液态琼脂糖培养基用吸管以大约50ml一滴的量滴于直径6cm的培养皿，待其固化后向其中添加3ml液体培养基并于摇床上低速旋转培养。 培养过程中，通过调整液体培养基的渗透压来调节培养物的渗透压以利于其进一步的生长和发育，这种方法由于改善了培养物的通气和营养环境，从而促进了原生质体的分裂和细胞团的形成。 植物原生质体的分离与培养技术及制备 影响原生质体培养的因素 原生质体的活力 原生质体的起始密度 适宜密度在104~105个／ml左右。在烟草叶原生质体培养中，密度低于103个／ml时，细胞只能分裂一、二次，密度在104个／ml以上，植板率常显著提高。 渗透压稳定剂 培养基营养 原生质体培养经常使用的KM-P培养基就是以B5培养基