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实验室技术说明 消毒与灭菌 无菌操作技术主要包括五方面：培养基的灭菌、接种室的消毒、工作人员的清洁、材料接种 的无菌操作以及组培室的消毒 消毒与灭菌两者的意义有所不同o消毒一?般是指消灭病原菌和有害微生物的营养体而言，灭 菌则是指杀灭一切微生物的营养体，芽抱和砲子。 实验室常用消毒灭菌方法： 火焰烧灼 火焰烧灼灭菌适用于接种环，接种针和金属用具如银子等，无菌操作吋的试管口 和瓶口也在火焰上作短暂烧灼灭菌。 丁热灭菌 通常所说的干热灭菌是在电烤箱内利用高温T：燥空气仃60°C?170°C, 1?2h）进 行灭菌，此法适用于玻璃器皿如吸管和培养皿等的灭菌。培养基、橡胶制品、犁?料制品不能 用干热灭菌。 高床蒸气灭菌法适用于培养基、工作服、橡皮物砧等的灭菌，也可用于玻璃器皿的灭菌。 一般培养基用0. IMPa, 121. 5°C, 15?30min可达到彻底灭菌的目的。 在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋 白质较易凝固，因蛋白质含水量増加，所需凝固温度降低，二是湿热的穿透力比干热大，三 是湿热的蒸汽有潜热存在。 在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重耍，I大1为空气的膨胀 压大于水蒸汽的膨胀压,所以,当水蒸汽中含有空气时,在同一压力下，含空气蒸汽的温度 低于饱和蒸汽的温度。 紫外线灭菌 紫外线灭菌是用紫外线灯照射进行的。波长为200^300nm的紫外线都有杀菌能 力，其屮以260nm的杀菌力最强。在波长一定的条件下，紫外线的杀菌效率与强度和吋间的 乘积成正比。紫外线杀菌机理主要是因为它诱导了胸腺喘唳二聚体的形成和DNA链的交联， 从而抑制了 DNA的复制。另一方面，山于辐射能使空气中的氧电离成[0],再使Ch氧化生成 臭氧（0s）或使水（IL0）氧化生成过氧化氢（IbOJ。0：；和IIO均有杀菌作用。紫外线穿透力弱， 所以，只适用于无菌室、超净工作台内的空气及物体农面的灭菌。紫外线灯距照射物以不超 id 1.2m 为宜。 培养基灭菌 无菌操作前用酒精棉球（75%乙醇）擦于消毒。 培养，挑菌落倒平板涂彳j微生物的纯化培养 培养，挑菌落 倒平板 涂彳j 1 ?稀释涂布平板法 平板划线分离法 倒平板，划线，挑菌落一、细菌的接种技术 平板划线接种法（分离培养法） （1）右手拿接种环，烧灼冷却后，収葡萄球菌与大肠杆菌混合菌液一环。 （2） 左手斜持（45度角）琼脂平板，略开盖，在酒精灯火焰左前上方约5?6cm处，将接种 环上Z菌液接种于平板表面一侧边缘作原划线。 （3） 烧灼接种环，冷却后将接种环白原划线之末端沾取少许菌液，使接种环与平板表面 成30?40度角，用腕力将接种环在平板表而來冋划线，划线要密但不能重叠，充分利用平 板的面积，不要划破琼脂表面，并注意无菌操作，防止空气中微生物的污染（图4-l）o 也可用分区划线法，即从原划线末端取菌液后只划平板的1/4?1/5,划玩后再经火焰灭菌，冷却后用同样方法划线，共计4?5次。接种完毕将接种环烧灼灭菌后方可放下（图4— 2） 图4-2平行划线和分区划线图形示图 接种 (3) 4.涂彳j平板操作: 右手持盛培养基三角瓶置火焰旁边，用左手瓶塞轻轻地拔出，瓶口保持对着火焰；然后用右 手手撑边缘或小指与无名指夹住瓶塞（也町将试瓶塞放在左手边缘或小指与无名指之间夹 住。如果试管内或三角瓶内的培养基一次用完，管塞或瓶塞则不必夹在于中）。左于?拿培养 皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15ml,加盖后轻轻摇动培养皿，使培 养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌而上，待凝后即为平板。 样品名称 菌落数 菌落类型 大小 形态 干湿 高度 5.挑菌落 环境因素对微生物的影响（单因素对比法） 常用计量单位 1000进制： 毫米（mm）,微米（U m ）纳米（nm ） 毫升（ml）,微升（U 1） 毫摩尔（mmol/1）微摩尔（卩mol/1） 实验用具洗涤方法 实验开始前以及实验结束后，所有器皿都要经过高压灭菌。特别是用过的培养基，在培养后, 产生大彊的彫响人体健康的或污染环境的菌体。取样器的枪头要先在超声波淸洗器那个加去 污粉洗涤30min,才可在使用》。封口膜也是这样处理。 培养基配置（4种培养基） 常用指示剂 指示剂 色调变更 酸-殓 PH 感应界 稀释0.1 g指 示剂所需的 10 mol/L NaOH/mL 加蒸IS水 到下列 S/mL 质竜 分数 /% 10mL培养基 需加指示 剂的数fi/mL 澳酚蓝 Bromphenol blue 黄一蓝 3.0-4.6 1.49 250 0.04 0.5 禳甲酚紫 Bnxncresol purple 黄一紫 5.2-6.8 1.85 250 0.(M 0.5 澳百里酚蓝 Brom