高表达AKT3在宫颈癌顺铂获得性耐药中的功能研究.pdfVIP

摘要 宫颈癌（cervical carcinoma ）的发病率在女性恶性肿瘤中居第三位，仅次于乳腺 癌。其死亡率高居第二位，严重危害女性健康。中晚期宫颈癌患者治疗以放化疗为主 顺铂（Cisplatin ，DDP ）作为治疗宫颈癌的一线化疗药物在临床中使用广泛。然而治 疗过程中产生的获得性耐药是其难治愈的原因之一。 为探究潜在的顺铂耐药分子机制，我们在本研究中建立了人宫颈癌细胞顺铂耐药 细胞系模型Hela/DDP ，随后通过转录组测序(Transcriptome Sequencing, RNA-Seq)检 测与Hela/DDP 与Hela 细胞中转录本表达。分析后筛选获得性耐药相关的差异表达基 因。 通过RNA-Seq 数据比较人Hela/DDP 与其亲本细胞系Hela 的基因相对表达量， 结果发现2,312 个差异表达基因 （Differentially Expressed Genes, DEGs ）。其中包括 1,437 个上调基因和875 个下调基因。将DEGs 在GO ，COG 和KEGG 数据库进行聚 类分析。根据 KEGG 数据库分析结果，细胞中差异表达基因富集最多的信号通路为 PI3K/AKT 信号通路。 实时荧光定量 PCR （RT-qPCR ）实验初步验证显示六个上调基因：WNT10B ， INHBB ，CACNA1H ，HSP90B1 ，CREB5 和AKT3，与八个下调基因SIPA1L1，FLNC ， LAMA4 ，CD70 ，PDGFC ，CREB3L1 ，COL4A6 和IL1A 的mRNA 相对表达量与测 序结果一致。进一步研究AKT3 基因的功能。由于AKT3 在Hela/DDP 细胞中高表达， 因此通过RNAi 干扰实验与抑制剂处理后，qRT-PCR 实验均表明AKT3 表达量下降, Western Blot 结果显示pAKT 表达被抑制。CCK-8 实验表明低表达的AKT3/pAKT 加 强耐药细胞对顺铂的敏感性。细胞凋亡结果表明抑制AKT3 表达后，Hela/DDP 凋亡 率增加。 基于上述实验结果，本研究中发现AKT3 高表达或是导致宫颈癌细胞产生对顺铂 的耐受性的分子机制之一，也许能对抑制或逆转宫颈癌顺铂耐药的策略提供一定的实 验依据。 关键词：宫颈癌，顺铂，耐药，差异表达基因 I 目录 摘要I ABSTRACTIII 缩略语对照表V 第一章 绪论 1 1.1 宫颈癌耐药概述 1 1.1.1 宫颈癌简介 1 1.1.2 宫颈癌的治疗 1 1.2 顺铂概述2 1.3 个体化用药的概述4 1.4 转录组测序概述4 1.5 PI3K/AKT 信号通路概述5 1.6 MK-2206 2HCl 简介7 1.7 研究内容及意义8 第二章 实验材料及方法9 2.1 实验材料9 2.1.1 宫颈癌细胞株9 2.1.2 实验试剂9 2.1.3 实验耗材 10 2.1.4 实验仪器 11 2.1.5 常用缓冲液的配制 11 2.2 细胞实验 14 2.2.1 传代培养 15 2.2.2 细胞换液 15 2.2.3 细胞冻存 15 2.2.4 细胞复苏 16 2.3 耐药株构建 16 2.4 细胞毒性实验 17 2.5 转录组测序与