N25改变碳酸钙形貌的机理及框架蛋白分布模式的研究.pdfVIP

摘 要 摘 要 合浦珠母贝（Pinctada fucata ）是研究贝类矿化机理的研究物种之一，其珍珠 层具有优良的性能而受到关注，对于贝壳形成原理的探索是本领域的研究热点之 一。在之前的研究中通过基因芯片测定不同发育时期各基因转录水平的高低，结 合基质蛋白特征筛选出若干基质蛋白候选基因，它们的具体功能还需要深入研究。 本研究选取其中的一个 unigene 进行克隆和功能鉴定，命名为 mantle protein N25 （简称N25 ），论文首先深入分析了N25 蛋白的功能和影响矿化的机理。通过 RACE 克隆获得了N25 基因的全长，检测到该基因在外套膜组织中特异性表达。 本研究使用原核表达纯化难溶性基质蛋白N25 的包涵体，再利用蛋白质重折叠获 得了具有活性的可溶性蛋白，初步建立一种通过包涵体复性获得难溶性基质蛋白 的方案。纯化获得的N25 蛋白具有结合方解石、文石和几丁质的能力。贝壳组分 的免疫印迹显示N25 蛋白分布于棱柱层和珍珠层的不可溶性组分。N25 蛋白对方 解石和文石的结晶形貌都有明显的影响，我们使用结构光照明显微镜对 Cy5 标记 的N25 在方解石上的分布进行了成像定位，结果显示N25 蛋白只分布在晶体表面 而不进入晶体内部。借助软件计算模拟的方法，我们得到了符合预期的方解石形 貌模拟，并推测N25 蛋白通过结合晶体特定晶面和降低晶面吸附能的方式调控方 解石外形。此外，我们通过真核细胞表达N25-EGFP 蛋白的方法跟踪观察N25 蛋 白的分泌过程，研究表明N25 通过细胞囊泡分泌的方式离开细胞。 通过使用 SDS、DTT 分步处理贝壳珍珠层和棱柱层的不溶性框架，我们从中 洗脱下来了不同的基质蛋白组分。N19 蛋白富含较多的Cys 氨基酸，在DTT 处理 的时候从框架上解离下来，推测N19 可能通过二硫键连接在其他大分子上。一些 框架蛋白以几丁质结合结构域与框架产生非共价的连接，在SDS 处理后较容易解 离下来。而一些基质蛋白既没有 Cys 残基也没有几丁质结合域，却能够牢靠地结 合框架。这些现象表明，贝壳框架的组成和组装是多层次而且复杂的。 关键词：N25 ；方解石；晶貌；吸附能；框架蛋白 I 目 录 目 录 第1 章 前言 1 1.1 选题背景及意义 1 1.2 文献综述 2 1.2.1 生物矿化概述 2 1.2.2 基质蛋白概述 8 1.2.3 软体动物和贝壳的矿化 15 1.2.4 矿化的模型 18 1.2.6 合浦珠母贝发育过程 22 1.3 论文研究方法 24 1.4 论文结构 24 第2 章 实验材料与方法 25 2.1 实验材料 25 2.2.1 实验动物 25 2.2.2 细胞培养试剂 25 2.2.3 分子与生化试剂 25 2.2 实验仪器 26 2.3 实验方法 27 2.3.1 贝外套膜组织RNA 抽提 27 2.3.2 RNA 浓度测定和质量检验 27 2.3.3 N25 基因的全长克隆 27 2.3.4 RACE 引物设计 28 2.3.5 RACE 克隆末端序列 29 2.3.6 PCR 产物的回收和测序 31 2.3.7 基因全长的鉴定 32 2.3.8 组织分布检测 33 2.3.9 N25 真核表达载体构建和细胞转染 34 2.3.10 N25 蛋白原核表达纯化 35 2.3.11 MBP 、PLS 、PSLS 以及TF-N24 的表达纯化 37