蛋白质的研究方法 高级生物化学教学PPT课件.ppt

* 2.优点：具有高度的吸附专一性 层析过程简便、快速 3.载体的选择： (1)必须具有高度亲水性，使Pr分子容易与它接近. (2)非专一性吸附要十分小。 (3)必须具有大量可供活化而能与配基结合的基团。 ? 常用载体：纤维素、 葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、 聚丙烯酸胺凝胶和多孔玻璃等。 * 高效液相层析法（High Performance Liquid Chromatography ，HPLC） 又称“高压液相色谱，是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。 * HPLC包括： 输液系统：驱动流动相和样品通过色谱分离柱和检测系统 层析柱：分离样品中的各个物质 进样器：将待分析样品引入色谱系统 检测系统：将被分析组在柱流出液中浓度的变化转化为光学或电学信号 ，并分析显示出来 * * 蛋白质的检测和鉴定 * 一般可通过以下几个方面进行： 光谱学特性 电泳行为 特异抗体反应 特异生物学活性 N一末端氨基酸序列测定 质谱检测 排阻层析 * 一、光谱学特性 光谱特性的总原则是： 当一定波长的光（即电磁波）与Pr分子接触时，所吸收的或反射的辐射能量与Pr分子结构特征和浓度是密切相关的。 * 不同波长范围的电磁波与其作用后的剩余能量值反映的是蛋白质分子的不同特征: 190 --200nm波长范围的光吸收反映的是蛋白质主链上的酰胺键中电子的被激发； 230 - 300nm波长范围的光吸收谱（最大吸收值在280nm波长处）反映的是蛋白质分子中芳香族氨基酸侧链上电子的被激发。 所以一般情况下，溶液在280nm波长处（属紫外 光范围）的光吸收能力被当做是存在蛋白质的证据。 * 二、电泳检测 蛋白质分子为两性电解质，在不同pH的溶液中带有不同的电荷，从而在直流电场中能够泳动，这就是电泳现象。 按介质状态来分:自由电泳 区带电泳 按操作原理可分为: 一般电泳 等电电泳 等电聚焦电泳 免疫电泳等 * 自由电泳--以溶液为介质，在溶液中将蛋白质分离 缺点:自由电泳过程中扩散严重，分辨率有限 区带电泳--在固体支持物上所进行的电泳． 固体支持物有:滤纸、 醋酸纤维薄膜、 　　　　　　　　 琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 优点:分辨率很高。 * SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS– (十二烷基硫酸钠)是阴离子型去污剂 (Sodium dodecyl sulfate, SDS) SDS一凝胶电泳可以按蛋白质分子大小的不同将其分开。 这时，若以分子量的对数（logM）对相对于染料前沿 的迁移率（Rf）作图，呈现线性关系。 a b * * 这种关系，对一种胶浓度时，只适用于一定的 分子量范围： 5％胶浓度时，适用于分子量6～200万的区间； 10％胶浓度时，适用于分子量1.6～7万的区间； 15％胶浓度时，适用于分子量1.2～4.5万的区间。 等电聚焦电泳——（isoelectric focusing, IEF） 是一种根据样品的等电点不同而使它们在pH梯度中相互分离的一种电泳技术。 利用特殊的一种缓冲液（两性电解质）在凝胶（常用聚丙烯酰胺凝胶）内制造一个pH梯度。 pH梯度制作利用的两性电解质（ampholyte，商品名为ampholine），是脂肪族多胺和多羧类的同系物，他们具有相近但不同的pKa和pI值。在外电场作用下，自然形成pH梯度。凝胶可用：聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶等 * Pr分