2.1 动物细胞原代培养.pdf

第二章 动物细胞培养 第一节 动物细胞的原代培养 细胞原代培养是直接从生物体获取组织细胞进行培养。由于细胞刚刚从活体组织 分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。细胞原代培养为研究生物体细胞的生长、 代谢、繁殖提供有力的手段，同时也为细胞传代培养创造条件。 按照组织来源不同，我们可采用组织块法和分散细胞法进行原代培养 （图1），例 如心肌细胞、皮肤细胞可采用组织块法，肝脏细胞、肾脏细胞、软质肿瘤细胞可采用 分散细胞法。 图 1 按照组织来源不同，我可采用组织块法和分散细胞法进行原代培养 组织块法是将剪碎的组织块直接粘附在培养器皿的壁上，加入培养基后进行培养， 随着培养时间的延长，细胞自行从组织块中向外迁移，待迁出的细胞长至生长面积一 半以上时即可传代。组织块法适合于从样品量较少的组织中分离细胞并建立原代培养。 分散细胞法是采用机械法或酶消化法使细胞从组织块中解离。如脾、肝、脑、软 质肿瘤等。通注射器挤压，筛网挤压过滤、反复吹打等方法使细胞彼此离散，形成单 细胞悬液。 细胞原代培养前先要做好充分的准备，包括培养器材的准备，培养用液的准备和 培养环境的准备。细胞原代培养过程则主要包括取材、组织分离、解离组织块、分离 细胞，接种至培养器瓶中，CO2 培养箱静置培养等步骤。 用于细胞原代培的器材主要有培养瓶（图 2），培养皿，离心管，解剖器材等。用 于原代细胞培养的器材必须无菌，无菌包装的器材需查看保质期以及包装是否完整。 非无菌包装器材需要经过灭菌处理。 图2 原代细胞培养器材的准备 常用的细胞培养用液有：培养基（RPMI1640，是常用的基础培养基，图 3），培养 基中需要添加 10%的血清 FBS，1%的双抗（青霉素/链霉素）、PBS、Hank’s 缓冲液 （图）等。无菌包装的培养用液需要查看包装的完整性或有无破损，自己配制的培养 基或 PBS 等均需用 0.45 um 的滤膜过滤除菌，这就是用于过滤的滤器 （图3）。 图 3 细胞培养液过滤的滤器 细胞培养通常在专用的无菌室或超净工作台（图 4）中进行。开展细胞培养之前， 无菌室和超净工作台均需要开紫外灯进行灭菌处理（图片）。紫外灯一般处理 20-30 min，无菌室紫外灯熄灭 20min 后，人才能进入。 细胞培养室无菌室 超净工作台 图4 无菌室和超净工作台 细胞培养操作者在进入无菌室前需要洗手、带头套、戴口罩、戴手套，70%酒精处 理手及操作界面。 细胞原代培养第一步，取材分离组织，先取小鼠，将小鼠拉颈椎处死，置入 70% 酒精浸泡杀菌，移到超级工作台中 无菌环境取出小鼠（或乳鼠），放置在操作盘中， 用手术器械逐层分离皮肤和肌肉组层，打开腹腔和胸腔。注意不同的解剖层次使 用不同的消毒器械。最后取出心脏和肾脏，置于无菌平皿内。用 Hanks 液洗涤 3 次。 第二步，解离组织，用弯头剪分别把心脏和肾脏组织剪碎，每个组织块大约 1mm3 左右，用 Hanks 液洗涤 2-3 次，自然沉淀，用吸管吸去上清液。 心肌组织我们采用组织块法，就是将剪碎的组织块中加入 0.5-1 ML 培养基，吸取 组织块悬液，转入细胞培养瓶中，尽量让组织块铺展