测量蛋白质含量的方法.pdfVIP

蛋白质含量测定 蛋白质含量测定方法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析之一。目前常 用的方法有凯氏定氮法(Kjedahl）、双缩脲法(Biuret)、紫外吸收法、考马斯亮蓝 法(Bradford)。其中Bradford 法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10~20倍Biuret 法灵敏100倍以上。凯氏定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋 白质作为其他方法的标准蛋白质。 1.凯氏定氮法 1．1原理 凯氏定氮法测定蛋白质分为样品消化、蒸馏、吸 收和滴定4个过程。其原理是样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂作用下共热 消化，含氮有机物分解产生氨，氨又与—酸作用，变成硫酸铵。然后加碱蒸馏 放出氨，氨用过量的硼酸溶液吸收，再用盐酸标准溶液滴定求出总氮量换算为蛋白 质含量。 1．2特点 凯氏定氮法是目前分析有机化合物含氮量常用的方法，是测定试样中总有机氮最准 确和最简单的方法之一，被国际国内作为法定的标准检验方法。该凯氏定氮法适用 范围广泛，用于标准蛋白质的准确测定，干扰少，干扰是非蛋白氮（可用三氯乙酸 沉淀蛋白质而分离）测定结果准确，重现性好，但操作复杂费时，试剂消耗量大。 费时太长，通常8-10个小时，灵敏度低，测定范围是0.2-1.0mg。 2.双缩脲法 2．1原理 双缩脲(N}I3C0NHC0NH是两个分子脲经180℃左右加热，放出1个分子氨后得到的产 物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两 个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能够以1个中间碳原子相连的肽键，这类化合 物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子 量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。 2.2特点 双缩脲法中样品的取用量对测定结果的准确性有显著影响.采用0．5g样品，40mL双 缩脲试剂的比例具有较高的检测精度。双缩脲法对不同的蛋白质产生颜色的深浅相 近，不受温度的影响。可快速测定蛋白质含量，试剂单一，方法简便，干扰物质 少，如硫酸铵，Tris缓冲液，某些氨基酸。但灵敏度差，测定范围为l～2Omg蛋白 质，20-30min。适用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定，常用于谷物 蛋白质含量测定。 3.紫外光吸收法 1 3．1原理 蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具 有吸收紫外光的性质，吸收峰在280nm处，其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成 正比。此外，蛋白质溶液在238nrll的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长 下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测 定。 3．2特点 最常用的紫外吸收法是280nm的光吸收法，紫外吸收法简便、较灵敏、快速，不消 耗样品，低浓度盐类不干扰测定，测定后仍能回收使用。较高灵敏，测定范围是 50-100ug，用于层析柱流出液的检测，时间较快，5-10min。缺点是，准确度较 差，干扰物质多，用标准曲线法测定蛋白质含量时，对于那些与标准蛋白中酪氨酸 和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸关， 等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行 计算的方法加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同 的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。紫外吸收法测定时，由于蛋 白质吸收高峰常因pH的改变而有变化，因此要注意溶液的pH值，测定样品时的pH要 与测定标准曲线的pH相一致。 4.考马斯亮蓝法(Bradford) 4.1原理 Bradford法是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。考马斯亮蓝是一种有机 染料，在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中与蛋白质的碱性氨基酸(特别是精氨酸) 和芳香族氨基酸残基结合后变为蓝色，其最大吸收波长从465nm变为595nm，蛋白质 在1～1000ug范围内，蛋白质一色素结合物在595nm波长下的吸光度与蛋白质含量成 正比，故可用于蛋白质的定量测定。 4.2特点 考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合反应十分迅速而稳定，2min左右即达到平衡其 结合物室温下1h内保持稳定，且在5～20min之间，颜色的稳定性最好，颜色深浅随 蛋白质不同而变化该法方法简便，易于操作，所用试剂较少，显色剂易于配制。干 扰物质少，如糖、缓冲液、还原剂和络合剂等均不影响显色，灵敏度高，测定范围 是1-5ug。速度快，5-15min。此法的缺点是由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨 基酸