蛋白质分离纯化与表征方案.pptVIP

（三 ) 根据电荷不同的分离方法 1. 电泳 原理： ? 蛋白质在非等电点时所带总电荷不为 0 ? 分子大小不同，电场中移动速度也不同 ? 平板电泳 等电聚焦电泳 第 7 章 蛋白质的分离纯化和表征 蛋白质分离纯化是利用其特性的差异 ? 分子的大小和形状 ? 酸碱性质 ? 溶解度 ? 吸附性质 ? 对配体分子的特异生物学亲和力 蛋白质纯化应根据研究工作和生产的具体目的和要求， 制订分离纯化的合理程序。 蛋白质 含有酸 / 碱 AA 残基 具有两性 碱 / 酸 越大 —— pI 越大 ? pI 通常在 6.0 左右 一、蛋白质的酸碱性质 蛋白质的分子量 一般在一万至一百万道尔顿之间 1 道尔顿＝ 1 × C 12 绝对质量 /12 ≈1.66 × 10 -27 千克 二、蛋白质分子的大小与形状 测定蛋白质相对分子质量的原理和方法 （一） 根据化学组成测定最低相对分子质量 （二） 渗透压法测定相对分子质量 （三） 蛋白质的扩散和扩散系数 （四） 沉降分析法测定相对分子质量 （五） 凝胶过滤法测定相对分子质量 （六） SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质 量 （一）根据化学组成测定最小分子量 1 、测定蛋白质中某一微量元素的含量 2 、假设蛋白质中仅含一个铁原子 最低相对分子质量 = 100* 55.8 / 铁的百分含量 例如肌红蛋白含铁量为 0.335% ，那么其最低相对 分子质量就是 55.8/0.335 × 100 = 16700 （五）凝胶过滤法测定相对分子质量 蛋白质分子通 过凝胶柱的速 度并不取决于 分子的质量， 而是它的斯托 克半价。 如果某种蛋白质与一理想的非水化球体过柱速度相同， 则认为具有与该球体相同的半径，称斯托克半径 蛋白质混合样 ? 标准蛋白质（已知 Mr 和斯托克半径）和待测 蛋白质必须具有相同的分子形状（接近球形） （六） SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳法 测定相对分子质量 蛋白质颗粒在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时， 它的迁移率取决于： ? 所带电荷 ? 分子量 ? 分子形状 但是如果在该系统中添加 SDS 和少量巯基乙醇，则蛋 白质分子的电泳迁移率主要取决于它的相对分子质量。 十二烷基磺酸钠 原态蛋白质 变性 ？ 磺酸基 极性亲水 烷基 亲油 （蛋白质疏水区） 迁移率与电荷和形状无关，仅取决于 相对分子质量 巯基乙醇破坏二硫键 蛋白质分子的形状 蛋白质分子在溶液中的形状或构象的信息，可 借助其摩擦系数与理想球体的摩擦系数之比， 也就是所谓的蛋白质分子的摩擦比来推测。 摩擦比越大，蛋白质分子的不对称性越高。 三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 （一） 胶体性质 （ colloidal system ） 胶体溶液的特点： ? 分子直径在 1-100 nm 内 ? 溶于水 ? 不易聚集沉淀 大多数球状蛋白能形成稳定的亲水胶体溶液 蛋白质胶体溶液的稳定因素： 1. 同种蛋白带同种电荷，相互排斥 2. 水膜弹性 3. 质点的大小（ 1 ～ 100nm ） ? 蛋白质溶液具有丁达尔效应、布朗 运动以及不能通过半透膜等性质 （二）蛋白质的沉淀 Pr 从胶体溶液中析出 任何破坏稳定蛋白质溶液的因素都可能使蛋白 质沉淀 I 可逆沉淀 – 温和 条件，改变溶液 pH 或 Pr 所带电荷 – Pr 结构和性质没有变化 – 适当条件下可 重新溶解 —— 非变性沉淀 ? pI 沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等 不可逆沉淀 ? 强烈 沉淀条件 ? 破坏 Pr 胶体溶液 稳定性 ? 也破坏 Pr 结构和性质 ? 沉淀 不能再重新溶解 —— 变性沉淀 ? 如加热沉淀、强酸 / 碱沉淀、重金属盐 和生物碱沉淀等 Ⅱ 1. 盐析法 加入大量中性盐（硫酸铵、硫酸钠 和氯化钠）脱去蛋白质的水化层， 盐析一般不引起变性 ? 等电点沉淀的蛋白质溶液中 加入 NaCl 后沉 淀溶解 — 盐溶 ? 原因？ 盐溶 — 盐析 分子在等电点时，相互吸引，聚合沉淀， 加入少 量盐离子 后破坏了这种吸引力，使分子分散， 溶于水中 盐溶