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精品文档 项目十六 免疫细胞的分离 一、抗凝血的制备 【实验原理 】 常用的抗凝剂如肝素能阻止凝血酶的形成；乙二胺四乙酸 (EDTA) 和柠檬酸能与 Ca2+ 结 合；机械脱纤维使血液中血小板和纤维蛋白凝聚； 从而都能阻止血液凝固。 实验室常用的抗 凝方法有如下几种：肝素抗凝、 EDTA 抗凝、脱纤维抗凝及 Alsever 液抗凝等方法。 【试剂和器材 】 1．试剂 肝素、 EDTA-Na 2、Alsever 液、生理盐水等。 2．器材 三角烧瓶、玻璃珠、试管或离心管、采血器具。 【步骤和方法 】 1．肝素抗凝法 将 肝 素 用 生 理 盐 水 配 制 成 250U/ml 或 其 它 浓 度 的 溶 液 ， 115℃ 灭 菌 10min( 或 112℃15min) ，置-20 ℃可保存数月。实验中常用的肝素抗凝浓度为 20~50U/ml 血液，实际当 肝素浓度为 5~10U/ml 血液时已显出良好的抗凝效果。 2．EDTA 法 常用 EDTA 二钠盐 (EDTA-Na 2 ) ，用生理盐水配制成浓度为 27g/L 的溶液。配制时将溶 液调至 pH7.2 ，否则 EDTA-Na 2 不溶解。用时取 0.05ml 即可使 1ml 血液抗凝。 EDTA-Na 2 有 效抗凝浓度为 1~2mg/ml 血液。 3．脱纤维法 在三角烧瓶中放入一些小玻璃珠 (放入数目视采血量多少而定，通常放 30~40 粒 )，将血 采入后立即轻轻顺一个方向旋转，直到血纤维凝聚为止。 4 ．Alsever 液抗凝法 血液与 Aalsever 液混合比例为 1:1~1:2。 【结果判定 】 除玻璃珠脱纤维法有血纤维凝聚之外，抗凝血中不能有血凝块出现，否则应重新制备。 【注意事项 】 1．采血所用器具、抗凝剂、操作过程均应无菌。 2．加入血液后应轻轻混合， 直到与抗凝剂均匀混合为止。 常采用旋转混合的方法混匀。 3．抗凝血放 4℃保存。 【方法评价 】 肝素制备的抗凝血不易长期保存 (保存时间 12h)。EDTA 法能保持血小板与白细胞的正 常形态，避免聚集。 脱纤维法可使少量淋巴细胞丢失，但是悬液中细胞活力好，而且血小板 污染甚少。 Alsever 可较长时间保存血液，一般可保存 2~3 周。 【临床意义 】 抗凝血的制备是实验室常用的基本技术之一，在免疫试验及血细胞的检测中被广泛利 用，是医学检验专业学生必须掌握的基本技能之一。 【思考题 】 1．实验室血液抗凝法有哪些？抗凝的原理如何？ 2．不同抗凝法有何特点？试设想不同试验中应如何选择抗凝方法？ 二、外周血中免疫细胞的分离 . 精品文档 (Extrication of immunocyte from peripheral blood) (一) 白细胞制备 【实验原理 】 血液中白细胞的分离方法常用自然沉降法或利用高分子聚合物加速红细胞沉降的方法 来分离白细胞。 因血液中红细胞的密度比其它血细胞密度大， 故红细胞沉降率较快， 而且高 分子聚合物能使红细胞凝聚成串钱状，加速其沉降，故而从血浆层中可分离