免疫组化操作步骤[汇编].docxVIP

精品资源·有用参阅品 文档收拾 | 学习参阅 Summary compilation 免疫组化操作进程 ????????????????第一节 免疫组化操作进程及抗原修正（供参阅）????????????????第二节 免疫组化抗原热修正的技能要害（供参阅）（一）、仪器设备1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉.2. 水浴锅（二）、试 剂1. PBS缓冲液（pH7.2―7.4）2．0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,pH6.0,1000ml）3. 3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液制造4. 风裱剂：a. 甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0–9.5）等量混合 b 油和TBS(PBS)制造5．TBS/PBS pH9.0–9.5,适用于荧光纤维镜标本;pH7.0-7.4合适光学纤维标本（三）、操作流程1、脱蜡和水化：脱蜡前应将安排芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。a 安排芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,替换二甲苯后在浸泡10分钟b 无水乙醇中浸泡五分钟c 95%乙醇中浸泡五分钟d 75%乙醇中浸泡五分钟2、抗原修正：用于福尔马林固定的白腊包埋安排芯片：???????????????????????? 抗 原 修 复（免疫组化白腊切片）????????用于福尔马林固定的白腊包埋安排芯片需求抗原修正????福尔马林固定的安排有或许破坏了本来安排的抗原结构，蛋白多肽发生交联，导致部分抗原表位关闭，结合位点削减，所以需求抗原修正，以露出本来的抗原表位，到达充沛露出抗原，以不呈现显着脱片现象为佳。????????????????抗原修正的几种常用办法（供参阅）????1. 微波炉加热：在微波炉里加热0.01枸橼酸钠缓冲液（pH6.0）至欢腾后将安排芯片放入，断电，距离5-10分钟，重复1-2次。依据玻片情况可参阅选用微波加热“3-5-3法”3分钟温火欢腾后停止5分钟，再温火欢腾3分钟即可。 适用的抗原：来源于人、大鼠、小鼠的安排标本；来源于其他动物种属的安排标本：????2. 沸热修正： 电炉或水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲液（pH6.0）至95℃左右，放入安排芯片加热10-15分钟。????3. 高压热修正：在沸水中参加EDTA(pH8.0)或0.01m枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能确定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡五分钟，然后将盖子确定，小阀门将会升起来。10分钟后除掉热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后翻开盖子。此办法适用于较难检测或核抗原的抗原修正。（骨及软骨安排的标本最好挑选较温文的微波加热修正）????4. 酶消化办法：常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶运用前预热37℃，消化时刻约为5-30分钟。适用于被固定遮盖的抗原：包含 Collagen.GFAP. Complement.Cytokeratin.c-erB-2.LCA.LN.等 ???????????????白腊切片免疫组化染色进程????????????????1.三步法（以SP试剂盒为例）●白腊切片脱蜡至水。●蒸馏水冲刷，PBS浸泡5分钟，假如选用抗原修正，可在此步后进行。●3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS冲刷，2分钟×3次。●5~10%正常山羊血清关闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加恰当份额稀释的一抗或一抗作业液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。●PBS冲刷，2分钟×3次。●滴加恰当份额稀释的生物素符号二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素符号二抗作业液，37℃或室温孵育10~20分钟。●PBS冲刷，2分钟×3次。●滴加恰当份额稀释的辣根酶符号链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶符号链霉卵白素作业液，37℃或室温孵育10~20分钟。●PBS冲刷，2分钟×3次。●显色剂显色（DAB或AEC）。●自来水充沛冲刷，复染，脱水通明、封片。●假如必要，可选用avdin关闭内源性生物素。????????????????2.SABC法（1） 脱蜡、水化 （2）PBS洗2次各5分钟 （3）用蒸馏水或PBS制造新鲜的3%H2O2，室温关闭5-10分钟，用蒸馏水洗3次（4）抗原修正（5） PBS洗5分钟 （6）滴加正常山羊血清关闭液，室温20分钟，甩去剩余液体（7）滴加Ι抗50ul,室温静置1小时或4℃过夜或37℃1小时（8）PBS洗3次各2分钟（9）滴加生物素化Ⅱ抗，20℃-37℃ 20分钟（10）PBS洗3次各2分钟 （11）滴加试剂