免疫组化染色操作步骤[整理].docxVIP

精品资源·有用参阅品 文档收拾 | 学习参阅 Summary compilation 免疫安排化学染色原理和操作进程 一、免疫安排化学原理 免疫安排化学（IHC）又称免疫细胞化学，是依据抗原—抗体特异性结合的原理，运用带有可见符号的特异性抗体作为探针，检测安排和细胞中抗原性物质的一种技能。免疫组化技能主要有直接法和直接法：直接法是以符号的一抗孵育标本以检测其间的抗原成分；直接规律先后参加一抗和二抗，构成抗原—一抗—二抗复合体以到达检测该抗原的意图，该法因二抗的扩大效果而具有较高的敏感性。直接法常用的有过氧化物酶—抗过氧化物酶（PAP）法、亲和素—生物素—过氧化物酶（ABC）法和链霉亲和素—过氧化物酶（SP）法。 PAP法一抗和二抗均不符号，防止了符号进程对抗体活性的影响，但需求制备过氧化物酶的抗体，与适量过氧化物酶混合构成PAP复合物（含3个酶分子和2个抗体分子），染色时顺次参加一抗、二抗、PAP复合物孵育标本，终究用H2O2和二氨基联苯（DAB）为底物显现过氧化物酶，即可检测标本中的抗原成分。 生物素为含硫的杂环单羧酸，可通过其羧基与蛋白质中的氨基结合，然后符号抗体和酶。亲合素又称抗生物素蛋白，与生物素有很高的亲合力，1分子亲合素可结合4分子生物素，ABC法即在此根底上树立。ABC法与PAP法类似，一抗不符号，二抗用生物素符号，染色前按必定份额将亲和素与生物素符号的过氧化物酶混合，制成ABC复合物，并使亲合素分子上至少空出一个生物素结合位点。在标本孵育过一抗和二抗后，再参加ABC复合物使其结合到二抗的生物素上，终究参加DAB进行显色。ABC法的敏感性较PAP法更高。 图1. 免疫安排化学基本原理示意图（引自八年制《安排学与胚胎学》） 图2. SP法原理示意图 SP法与ABC法类似，其不同于ABC法之处在于用生物学特性与亲和素类似的链亲和素符号过氧化物酶。在标本孵育过一抗和二抗后，参加链亲和素符号的过氧化物酶使其结合到二抗的生物素上，终究参加DAB进行显色。与亲和素比较，链酶亲和素的结合力与亲和素类似而非特异性结合较亲和素低。SP法简化了操作进程，一起也减少了非特异性布景，是现在运用最为广泛的免疫绥化染色技能。 试验预备： 标本预备①白腊包埋安排切片：由病理室惯例处理②冰冻安排切片：由病理室惯例处理③细胞爬片：将无菌盖玻片置于六孔板中，接种细胞，待细胞成长到达60％以上后取出玻片，4%多聚甲醛固定2 h。 试剂预备①抗体挑选单克隆抗体针对单一表位，具有较高的特异性，但在该表位损坏后将得不到阳性成果；多克隆抗体表位针对多个表位，可防止单克隆抗体的缺陷，可是或许出现非特异性杂交。因而，不管挑选单克隆仍是多克隆抗体，最好一起购买两个货号的抗体，购买抗体时必定要明确是可以做IHC的抗体，抗体阐明书上有必要有IHC测验成果。假如该分子文献报导较多，可挑选文献上常用的经典抗体。②二抗试剂盒现在本试验室所用二抗试剂盒为Life Technologies Histostain-Plus Kit (HRP, Broad Spectrum)，货号85-9043，一抗反响性有小鼠、大鼠、兔和豚鼠。③DAB试剂盒现在本试验室所用为加强型DAB显色试剂盒，货号DAB-2032。④其他试剂二甲苯、无水乙醇、苏木素、中性封片树脂、柠檬酸钠、APES胶 抗体特异性验证一切免疫组化抗体均须Western blot验证抗体特异性，并需免疫荧光试验验证抗原定位。 耗材预备免疫组化笔或许蜡笔、盖玻片、载玻片 溶液制造 ①磷酸盐缓冲液（PBS） 10×PBS母液制造 NaCl72 g Na2HPO4·12H2O37.3 g KH2PO44.3g 加蒸馏水至1000 ml，充沛混匀储存。 运用时用蒸馏水10倍稀释，调整pH值至7.3—7.4。 ②柠檬酸抗原修正液 抗原修正运用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，配方如下： 称取柠檬酸10.5 g，溶于500 ml蒸馏水；称取Na2HPO4·12H2O 57.3g，溶于800 ml蒸馏水。别离量取358 ml柠檬酸溶液和642 ml Na2HPO4溶液，充沛混匀后调整pH值至6.0，即得2×母液，储存备用。 ③1%盐酸酒精 浓盐酸与75%酒精依照1:99份额混合，充沛混匀。 三、免疫组化操作进程 安排片脱蜡水化①将安排片顺次放入3个装有二甲苯溶液的玻璃缸中浸泡，每缸15 min。②顺次放入2个装有无水乙醇的玻璃缸，每缸5 min。③顺次放入2个装有95%乙醇的玻璃缸，每缸5 min。④顺次放入90％乙醇、85％乙醇、75%乙醇的玻璃缸，每缸2 min，取出。⑤放入自来水、蒸馏水的玻璃缸中清洗，重复3次。 抗原修正将切片浸入1×柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，高压煮沸后继续加热2 min，然后中止加