重组DNA技术与基因工程教学PPT课件.ppt

启动子 受体基因 接头 目的基因 Met Arg Stop Lys Glu Ile-Glu-gly-Arg Arg Lys Glu Ile-Glu-gly-Arg 表达 亲和层析 酶解回收 融合型异源蛋白的表达 目的蛋白的回收 酶促裂解法：多残基位点 Asp-Asp-Asp-Asp-Lys Asp-Asp-Asp-Asp-Lys 寡聚型异源蛋白的表达 从理论上讲，外源基因的表达水平与受体细胞中可转录基因的拷贝数（即基因剂量）呈正相关。然而重组质粒除了含有外源基因外，还携带其它的可转录基因，如作为筛选标记的抗生素抗性基因等。随着重组质粒拷贝数的不断增加，受体细胞内的大部分能量和原料被用于合成所有的重组质粒编码蛋白，而细胞的正常生长代谢却因能量不济受到影响，因此通过增加质粒拷贝数提高外源基因表达产物的产量往往不能获得满意的效果。 另一种通过增加外源基因剂量而提高目标蛋白产量的有效方法是构建寡聚串联型异源蛋白表达载体，即将多拷贝的外源基因克隆在一个低拷贝质粒上，以取代单拷贝外源基因在高拷贝载体上表达的策略 寡聚型异源蛋白的表达 以寡聚形式表达目的蛋白的优缺点 目的蛋白高效表达 在不提高质粒拷贝数的前提下，增加目的基因的拷贝数，可以 稳定表达小分子短肽 在一定程度上改善表达量； 目的产物回收困难 短肽由于缺乏有效的空间结构，在细菌细胞中的半衰期较短。 串联短肽具有与蛋白质相似的长度及空间结构，因而抗蛋白酶 降解的能力大幅度提高； 寡聚短肽需要裂解和进一步分离，才能获最终分子，但裂解后 的短肽分子容易出现序列不均一性； 寡聚型异源蛋白的表达 寡聚型目的蛋白表达系统的构建 P SD gene gene gene gene T1 T2 H2N COOH Met Met Met Met mRNA CNBr 基本战略： 构建举例： P SD T1 T2 EcoRI BamHI AATTCAGATCT GTCTAGA G CCTAG EcoRI Bgl II BamHI EcoRI BamHI Bgl II GATCT A G CCTAG EcoRI BamHI Bgl II EcoRI BamHI Bgl II EcoRI + BamHI Bgl II + BamHI BamHI 寡聚型异源蛋白的表达 寡聚型目的蛋白表达系统的构建 整合型异源蛋白的表达 以整合形式表达目的蛋白的优缺点 目的基因稳定表达 整合型的目的基因随受体细胞染色体DNA的复制而复制，在大 多数情况下相当稳定，工程菌在没有选择压力存在下可以连续 目的基因表达率低 单拷贝整合的目的基因表达率受到限制，此时可通过强化表达 元件而加以补偿。 培养而不丢失目的基因表达盒，这对以改良物种遗传性状为目 的的基因工程案例特别有意义。 整合型异源蛋白的表达 DNA体内重组的基本原理 在生物体细胞尤其是原核细菌细胞内，广泛存在着DNA的遗传重组机制，其可能的生物学功效是促进生物种群的进化。细胞内的遗传重组可分为两大类： 转位因子依赖型 同源序列依赖型 整合型异源蛋白的表达 DNA体内重组的基本原理 转位因子是指生物细胞内天然存在的一类无复制能力的DNA可移动因子，不同生物种群拥有结构不同的转位因子，例如： 转位因子依赖型的体内重组：转位因子家族 噬菌体 G片段（G-Fragment） 原核细菌 插入顺序（IS） 真核细菌 转座子（Tn、Ty） 高等植物 可移动因子（Ac、Ds） 高等动物 跳跃基因（mobil gene） IS（1 kb） Ty（5 kb） Tn（2 - 20 kb） ACCATGGTT TTGGTACCA 抗药性基因 转位酶基因 识别位点 阻遏基因 IR IR IR IR IS IS 整合型异源蛋白的表达 DNA体内重组的基本原理 转位因子依赖型的体内重组：转位因子结构 整合型异源蛋白的表达 DNA体内重组的基本原理 转位因子依赖型的体内重组：整合形式 整合型异源蛋白的表达 DNA体内重组的基本原理 转位因子依赖型的体内重组：P1噬菌体的Cre-loxp系统 Cre Cre 5 - ATAACTTCGTATA - ATGTATGC - TATACGAAGTTAT - 3 3 - TATTGAAGCATAT - TACATACG - ATATGCTTCAATA - 5 loxP 反向重复序列 整合型异源蛋白的表达 DNA体内重组的基本原理 在很多原核细菌细胞中，染色体DNA链上的两个同源区之间可发生所谓的同源重组，其频率与细菌种类、两个同源区之间的距离同源区的长度、同源程度密切相关。一般地说，距离越远、长度越长、同源性越高