详细版蛋白质的化学修饰.pptVIP

.精品课件. * 二、根据化学组成测定分子量 .精品课件. * 二、凝胶过滤法 凝胶过滤法分离蛋白质的原理是根据蛋白质分子量的大小。由于不同排阻范围的葡聚糖凝胶具有特定的蛋白质分子量范围，在此范围内，分子量的对数和洗脱体积之间成线性关系。因此，用几种已知分子量的蛋白质为标准，进行凝胶层析，以每种蛋白质的洗脱体积对它们的分子量的对数作图，绘制出标准洗脱曲线。未知蛋白质在同样的条件下进行凝胶层析，根据其所用的洗脱体积，从标准曲线上可以求出此未知蛋白质对应的分子量。 .精品课件. * 层析法装置 .精品课件. * .精品课件. * .精品课件. * 优点 分离条件温和 回收率高 重复性好 设备简单 缺点 对样品的稀释大 流速慢 操作费时 .精品课件. * .精品课件. * 三、质谱法 【原理】 质谱仪是利用电磁学的原理，使带电的样品离子按质荷比进行分离的装置。离子电离后经过加速进入磁场中。其动能与加速电压及电荷Z有关。 Z：电荷数 ZeU=mv2/2 e：电荷(e = 1.60x10-19C) U：加速电压 m：离子的质量 v：离子被加速后的运动速度 .精品课件. * 具有速度v的带电离子进入质谱仪的电磁场中，根据所选择的分离方式，最终实现各种离子按m/z进行分离。 根据质量分析器的工作原理，可将质谱仪分为动态和静态仪器两大类，静态仪器采用稳定的电磁场，按空间位置来区别m/z不同的离子。动态仪器采用变化的电磁场，按时间不同来区分m/z不同的离子。 分离生物大分子多采用电喷质谱法，属于动态质谱仪。基本原理是生物大分子在很高的电场下电离。样品溶液以很低的流速，在高的电场下使生物分子从毛细管中流出來。 .精品课件. * 【方法】 样品溶液以很低的流速(1-20μl/分钟)从毛细管中流出来。在毛细管的柱头上施加一个高电压(1-5kv)，使柱头液体雾化成很细的带电液滴，这种带电液滴在逆向干燥气流中挥发，使液滴表面电荷密度增大。直到产生的库仑斥力与液滴表面张力的雷利极限值相等时，液滴就会发生爆裂，形成更小的子液滴，这些子液滴又被蒸发，又会形成爆裂。如此循环下去，直到液滴变得非常小，它的表面的电荷密度变得非常大，形成很强的电场，并从液滴中解离出带多电荷的分子离子。这些离子是靠吸附上或丢失若干质子而形成的，所以正离子或负离子谱上会观察到谱峰。生物大分子在ESI谱上往往是一组带不同的电荷的分子离子峰。 .精品课件. * .精品课件. * 核磁共振波谱(nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR).是将具有磁矩的核放入磁场后，用适宜的频率的电磁波照射，它们就会吸收能量，发生原子核能级的跃迁，同时产生核磁共振信号，得到核磁共振波谱。在有机化合物中，经常用于1H和13C核的共振吸收波谱。在生物学方面主要研究生物大分子的结构和分子量。到目前为止，采用1H 2D-NMR（二维NMR）能解决的最大蛋白质分子量在10000Da左右。如果采用杂核多维NMR技术，能解决的最大蛋白质分子量大在25000Da左右。 四、核磁共振波谱 .精品课件. * 方法 机理 分子量计算 关键技术 特点 电泳 分子表面电荷 电泳条带(mR) SDS包裹 单链分子 层析 分子质量 层析峰的位置 介质交联度 球形分子 质谱 质荷比 质谱峰直接标识 样品质子化 整体分子 核磁 核磁共振波谱 核磁谱线计算 磁场能量 整体分子 几种测定蛋白质分子量的方法比较 .精品课件. * 蛋白质的化学修饰 .精品课件. * 概 念 从广义上说：凡通过化学基团的引入或除去，而使蛋白质共价结构发生改变，都可以称为蛋白质的化学修饰。 包括两个方面：（1）侧链基团的改变；(2）主链结构的改变，前者属于化学修饰的范畴，而后者则属于基因重组和定点突变的方法。 .精品课件. * 蛋白质化学修饰的意义 改变蛋白质的药代动力学 调节蛋白质的稳定性以及活性 改变蛋白质的空间构象 .精品课件. * 化学修饰的原理 影响蛋白质化学修饰反应进程的因素有： 1 蛋白质功能基的反应性（亲核性） 1.1 基团之间的氢键及静电作用 1.2 基团之间的空间位阻 2 修饰剂的反应性 2.1 选择吸附 2.2 静电相互作用 2.3 位阻因素 .精品课件. * 化学修饰的