5.3血红蛋白的提取和分离.docxVIP

编写日期4 编写日期4月25日 使用日期 月 专题5 DNA和蛋白质技术课题3血红蛋白的提取和分离 主备人 田霜 审核人 孟凡荣 使用人 高二(生物) 教学目标 教学目标 教学重点 1、 尝试从血液中提取和分离血红蛋白 2、 了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理 凝胶色谱法的原理和方法 教学难点 样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填 备注教学过程 备注 基础知识 ?凝胶色谱法 1、概念：凝胶色谱法也称做 ，是根据 分离蛋白质的有效 万法。 2、原理：根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和 吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。 3、凝胶『①性质：一些微小的多孔球体，内含许多 3、凝胶『①性质：一些微小的多孔球体，内含许多 的通道，它只准许 蛋白质进入。化学本质：多糖类化合物---匍聚糖或琼脂糖。4、具体过程：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质 进入凝胶内部的 蛋白质进入。 化学本质：多糖类化合物---匍聚糖或琼脂糖。 4、具体过程：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质 进入凝胶内部的 通道，路程 ，移动速度 ；而相对分子质量 的蛋白质无法进入凝 胶内部的通道，只能在 移动，路程 ，移动速度 。相对分子质量不 同的蛋白质分子因此得以分离。 具体过程:3)说明:A.相对分子质量 较小的蛋白质凝胶颗粒, B 的蛋白质由于 作用进入凝胶颗粒内部而被滞留; 具体过程: 3) 说明: A. 相对分子质量 较小的蛋白质 凝胶颗粒 , B 的蛋白质由于 作用进入凝胶颗粒内部而被滞留; 的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之间迅速通过。 (1)、 混合物上柱; B. (2)、洗脱开始， 的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内； 的蛋白质被排阻于凝胶颗粒之外; (3)、 的蛋白质被滞留； 的蛋白质向下 移动。 (4)、 不同的蛋白质分子完全分开; (5 )、 的蛋白质行程较短，已从 中洗脱出来, 的蛋白质还在行进中。 、缓冲溶液 1、定义：在一定范围内，缓冲液能够抵制外界的 和 对溶液 的影响，维持 基本不变。 2、作用：能够抵制外界的酸或碱的对溶液的 PH值的影响，维持 PH 3、配制：通常由 种缓冲剂溶解于水中配制而成。 调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不 同PH范围内使用的缓冲液。 4、 缓冲剂：人体血浆的为 H2CO/NaHCO NaHPQ /Na 2HPQ 5、 实验必须使用缓冲溶液的原因：维持反应体系的 pH不变。 三、电泳 1、概念：指 在电场的作用下发生 的过程。 1). 1).许多重要的生物大分子，如 等都具有，在 一定 下，这些基团会带上 或 。 2、 原理（2）.在电场的作用下，这些带电分子会向着与其 的电极移动。 （3）.电泳利用了待分离样品中各种分子 以及分子本身 的 、 的不同，使带电分子产生不同的 ，从而实 现样品中各种分子的分离。 TOC \o 1-5 \h \z 3、 电泳的类型：常用的电泳方法是 和 等2 种，在测定蛋白质分子量时通常使用 。蛋白质在聚丙烯 酰胺凝胶中的迁移率取决于 以及 等因素。 4、 SDS的作用：使蛋白质发生完全 ，水解成单条肽链，使电泳迁移率完全取决 于 。 二、实验操作 1、 基本步骤：样品处理 T粗分离 T 纯化 T 纯度鉴定 2、 特别强调：每一种蛋白质的分离纯化方法因其来源和性质的不同差异 。 （一）样品处理及粗分离1、血液组成血冰分（血浆蛋白 浆 I无机盐［其它 （一）样品处理及粗分离 1、血液组成 血 冰分（血浆蛋白 浆 I无机盐 ［其它成分“磷脂 I葡萄糖等 f白细胞 I血细胞彳血小板 ，红细胞 （蛊多） （90%） 14个亚铁红素基团 ；血凝块 不加抗離剂 .元素组成：红色含铁的携氧蛋白质 。 .分子结构：血红蛋白由 条链组成，两条a链和两条B链。 2、血红蛋白. 2、血红蛋白 .存在细胞是红细胞的主要成分 。 .生理功能运输O2和部分CO L⑥.获得方法凝胶色谱法 步骤: 1、 红细胞的洗涤 洗涤红细胞的目的是 ，以利分离纯化。采集的血样要及时采用 分离红细胞，然后用胶头吸管吸出上层透明的 ，将下层暗红色的 液体倒入 烧杯，再加入 ，缓慢搅拌 10min，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直 至 ，表明红细胞已洗涤干净。 2、 血红蛋白的释放 在 和 作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。 3、分离血红蛋白溶液 TOC \o 1-5 \h \z 将搅拌好的混合溶液离心后，试管中的溶液分为 4层: ——第1层为无色透明的 ， E 第2层为白色薄层固体，是 ， 第3层是红色透明液体，这是 第4层是其他杂质的 将试管中的液体用滤纸过滤，