第3讲--用于核酸实际操作工具酶.pptVIP

一、限制性核酸内切酶 二、DNA连接酶 三、DNA聚合酶 四、外切核酸酶 五、核酸修饰酶;一、限制性核酸内切酶（restriction endonucleases） 1、限制性内切酶及其特点 识别双链DNA分子中的特定序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶,简称限制酶。 限制酶识别序列长度：4-8bp。 ;限制性内切酶 识别 特定的 碱基序列; 主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵。 细菌中还存在一种修饰酶，其作用是修饰限制酶作用部位的结构，使其自身的DNA不被限制酶分解。如把DNA中的A甲基化为6-N-CH3-A。 这种现象称为细菌限制修饰系统。 Werner Arber于1962-1968年发现， 1968年分离到I型限制酶。;大肠杆菌细胞中存在两种DNA甲基化酶：即DNA腺嘌呤甲基化酶（Dam酶）：作用：在5‘GATC3’序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有BclI、MboI、 EcoRI等，但BamHI、 BglII、Sau3AI不受影响。 ;DNA胞嘧啶甲基化酶（Dcm酶）：在5‘CCAGG 3’或5‘CCTGG3’序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoRII等。;表1 对甲基化敏感的限制性内切酶 限制酶 　　　识别序列* 　　 甲基化酶 AvaⅡ GG(A/T)CC(A/T)GG dcm BclⅠ TGATCA dam ClaⅠ GATCGAT dam EcoRⅡ CC(A/T)GG dcm HphⅠ GGTGATC dam MboⅠ GATC dam NruⅠ GATCGCGA dam Sau96Ⅰ GGNCC(A/T)GG dcm SauFⅠ CC(A/T)GG dcm StuⅠ AGGCCTGG dcm TagⅠ GATCGA dam XbaⅠ TCTAGATC dam *下横线字母表示限制酶识别序列, 蓝色字母表示dam甲基化酶识别序列,红色字母表示dcm甲基化酶识别序列;2、限制性核酸内切酶的类型 主要特性 I 型 II 型 III 型 限制修饰 多功能 单功能 双功能 蛋白结构 异源三聚体 同源二聚体 异源二聚体 辅助因子 ATP Mg2+ SAM Mg2+ ATP Mg2+ SAM 识别序列 EcoB:TGAN8TGCT 旋转对称序列 EcoP1:AGACC EcoK:AACN6GTGC EcoP15:CAGCAG 切割位点 距识别序列1-5kb处 序列内或附近 距识别序列 识别随机性切割 特异性切割 下游24-26bp处 切割无特异性 甲基位点 识别序列中的A 识别序列中的A; II型酶的发现： H.O.Smith 和K.W.Wilox 于1970年首次从流感嗜血杆菌（H. influenzae）中发现并分离到II型酶，至今已开发了2300多种II型酶。 ; 3、限制性内切酶的命名 由3部分构成： 属名 种名 菌株名 Haemophilus influenzae d 流感嗜血杆菌d株 H i n d III ，“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶 EcoRI—Escherichia coli（大肠杆菌）RI R表示编码该酶的基因位于大肠杆菌的 抗药性质粒上; 4、II 型限制酶的特性 （1）识别顺序和酶切位点 识别双链DNA分子中4 - 8对碱基的特定序列，大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧。 识别序列呈典型的“回文结构” EcoR I的切割位点 EcoR I的识别序列