克隆的DNA的分析与应用.pptVIP

J 克隆DNA的分析与应用;J1 克隆的鉴定;鉴定的内容：; 限制图谱 ;分子杂交是通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性标记的探针与被固定的分子杂交，经显影后显示出目的DNA或RNA分子所处的位置。根据被测定的对象，分子杂交基本可分为以下几大类： 　　(1) Southern杂交:DNA片段经电泳分离后,从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上,然后与探针杂交。被检对象为DNA,探针为DNA或RNA。 　　(2) Northern杂交:RNA片段经电泳后,从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上,然后用探针杂交。被检对象为RNA,探针为DNA或RNA。 ;基因测序 ;PCR发展速度 惊人，没有一种技术能与之相比 引用论文最多、应用范围十分广泛 1993年度诺贝尔化学奖：Mullis，与开创了“寡核苷酸基因定点诱变”加拿大籍英国科学家Michael Smith共获 ;原理 类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。 ;PCR的基本原理;PCR的基本原理;PCR的基本原理;PCR的基本原理;PCR的基本原理;;原理：DNA半保留复制的原理，在体外进行DNA的变性、复性和引物延伸。首先是dsDNA在高温下变性成为ssDNA，然后DNA聚合酶以ssDNA为摸板，利用聚合酶和dNTPS合成新生的DNA互补链。新合成的dsDNA经过变性、复性、延伸。如此反复循环，使目标DNA以指数形式扩增。 应用：扩增与分离目的基因；临床医疗诊断；胎儿性别鉴定；癌症治疗监控；基因突变与检测；分子进化研究；法医鉴定；商品检疫新药品的开发 ;PCR反应组份;模板 ;引物 ;酶 ;PCR循环：变性(94℃)、退火（50－60℃）、延伸（72℃） ;PCR的条件优化 ;PCR optimization 变性温度和时间 92-95℃，富含G和C的序列，可适当提高，但过高或时间过长都会导致酶活性损失。 退火温度与时间 引物中G、C含量高、长度长并与模板完全配对时，应提高温度。温度越高，产物特异性越高。通常37-55℃、1-2分钟。 延伸温度和时间 温度：72℃，接近Taq酶的最适75℃ 时间：过长会导致产物非特异性增加。但对低浓度的目的序列，则可适当增加时间。 循环次数 循环过多，非特异性产物大量增加 ;PCR污染及其对策 强大扩增能力+检测的敏感性 极微量的污染便可导致假阳性 污染源的追踪 ①点样器和加样器;②离心机;③微解剖刀;④浓缩用具、真空瓶;⑤电泳装置;⑥紫外灯箱;⑦乙醇或水浴锅;⑧冰箱门把手、实验台面等 ;污染的预防 隔离不同操作区 分装试剂 改进实验操作 专用加样器 (5)结果的重演 ;J3 克隆基因的组构 (不要求);核酸酶S1作图法（亦称Berk-sharp作图法）;引物延伸 ;研究基因表达的调控（一） 鉴定DNA分子上蛋白的结合位点;凝胶阻滞 结合蛋白后，DNA的分子量将会增加，电泳过程中，迁移率将会下降，这种方法称为gel retardation（凝胶滞后）。可被用来检测与调控序列相结合的转录因子。 ;Dnase I足迹法 ; DNA足迹分析技术可用于RNA聚合酶(蛋白质)结合序列的确定;（二）通过deletion分析鉴定控制序列;报告基因的选择原则： 首先它控制的是寄主生物体所没有的性状； 报告基因必须容易检测； 可以定量的研究。如：lacZ, neo, cat, dhfr, aphlV, lux, uidA。 ;图6-24 基因调控序列的结构? 　;J4 克隆基因的诱变 ;缺失诱变 ;定点诱变