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特异性小肽亲和整体柱对单抗药的富集纯化策略研究 随着单克隆抗体药物在药学、治疗学和诊断学上的迅猛发展 , 发展单克隆抗体药物的富集纯化技术变得十分重要。 目前使用最为广泛的是以蛋白质 A 为亲和配基的琼脂糖亲和色谱 , 虽然该方法特异性强 , 但是配基存在成本高、稳定性差、配基易脱落、易降解、对 pH 敏感、寿命短等缺点 , 同时 , 琼脂糖基质导致的非特异性吸附也为后续的纯化分析带来极大的困难。 小肽配基价格低廉、 化学性质稳定、生物相容性好、洗脱条件非常温和、使用寿命长 , 是替代蛋白质 A 的最佳候选者之一。另一方面 , 有机聚合物整体色谱柱的基质是由原位聚合得到的聚合物 , 具有孔隙度高、比表面积大、表面易修饰、耐酸碱性好等优点 , 更重要的是通过改变交联剂的种类可以显著降低材料表面的非特异性吸附。 本文的研究重点就是将小肽配基与有机聚合物整体材料相互结合 , 使用不同的制备方案 , 充分利用两者各自的优势 , 将其用于单克隆抗体药物的富集纯化。 同时结合小肽配基的研究现状 , 对小肽亲和整体柱在单抗药物富集纯化方面的应用潜力、发展方向进行了展望。第一章 , 系统介绍了蛋白纯化技术的分类及发展现状和小肽配基亲和纯化策略研究概况 , 并对其在单抗药物富集纯化中的应用研究进行了详细研讨 , 探讨了小肽配基与整体材料相结合的优势。同时总结了常见的 两大类制备方法对整体柱色谱性能的影响及各自带来的优缺点 , 并在此基础上提出了本论文的研究思路、实验方案及创新点。 第二章 ,His-tag-DAAG 被设计作为亲和配基 , 首次利用金属螯合多步法制备取得 DAAG功能化亲和整体柱 , 该制备方法首先以甲基丙烯酸缩甘油酯 (GMA)作为 单体 , 乙二醇二甲基丙烯酸酯 (EDMA)作为交联剂 , 偶氮二异丁腈 (AIBN) 为引发剂 , 水、异丙醇和 1,4- 丁二醇作为三元生孔体系 , 制备取得基质整体柱 poly(GMA-co-EDMA);然后 , 利用开环反应 , 将螯合剂 N,N- 双( 羧甲基 )-L- 赖氨酸 (ANTA)固定于材料表面 ; 接着 , 硫酸镍灌柱获得固定化镍离子亲和整体柱 ; 最后 , 将修饰后的小肽配基 His-tag-DAAG 以金属螯合的方式固定于整体柱 , 获得 DAAG 功能化亲和整体柱。 扫描电镜 (SEM)、元素分析、X 射线冷谱 (EDS)、荧光显微镜、 热重分析 (TGA)、傅里叶红外光谱 (FT-IR) 、压汞法、氮气吸附法和液相色谱等手 段被运用进行材料表征。 第三章 , 对金属螯合多步法制备获得的 DAAG功能化亲和 整体柱的亲和能力进行了系统考察。 通过对七种不同蛋白的色谱保留行为的研究 , 发现 DAAG功能化亲和整体柱比传统的固定化金属亲和整体柱特异性更强 ; 通过 前沿色谱分析技术 , 在 hIgG 和牛血清蛋白不同浓度或不同测试流速条件下 , 获得 DAAG功能化亲和整体柱和固定化镍离子亲和整体柱各自的动态吸附容量 , 以此绘制吸附等温线 , 拟合得到亲和参数 , 并进行详细比较 , 所有结果都表明 DAAG 功能化亲和整体柱具有更强的特异性、 选择性和吸附能力 ; 经过 20 次的重生循环使用 , 前 10 次的动态吸附量保持稳定 , 说明该柱稳定性较好 ; 为了考察其对实际 样品的应用潜力 , 该整体柱被用于赫赛汀细胞培养液中赫赛汀和人类血清中 IgG 的富集纯化 , 并将各组分进行了聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS)和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (MALDI-TOF MS)验证。 所有结果都表明 DAAG功能化亲和整体柱对单克隆抗体药物具有较好的亲和富集能力。第四章 , 鉴于金属螯合多步法制备 DAAG功能化亲和整体柱的过程较为 繁琐 , 本章尝试探索一步法和简化制备步骤的多步法。 以甲基丙烯酰修饰的 EDPW 小肽作为功能性单体 , 更为亲水的 N,N-亚甲基双丙烯酰胺 (MBA)作为交联剂 , 甲 醇和四氢呋喃作为生孔剂 , 通过一步法来制备 EDPW功能化亲和整体柱。通过对聚合物中各组成分的比例优化 , 最终得到了通透性好、柱压低、机械强度高的整体柱。 但是 , 特异性测试发现一步法制备的亲和整体柱存在配基包裹的问题。对于 简化制备步骤后的多步法 , 首先由 1- 乙烯基咪唑 (VIM) 为单体 ,MBA作为交联剂 , 甲醇和四氢呋喃作为生孔剂 , 制备 poly(VIM-co-MBA) 基质柱 , 通过对聚合物中各 组成分的比例优化 , 得到了柱压低、 通透性好、机械强度高的基质柱 ; 然后将硫酸 镍灌柱 , 制备获得功能化镍离子亲和整体柱 , 最后 His-tag-DAAG 小肽配基以螯合 的方式固定 , 获得 DAAG功能化亲和整体柱。通过特异性测