猪源噬菌体抗体库的构建与抗prrsv抗体的筛选.docxVIP

猪源噬菌体抗体库的构建与抗 PRRSV抗体的筛选 中和抗体能够与病毒表面的抗原结合 , 从而阻止病毒吸附靶细胞受体 , 防止 病毒侵入细胞 , 在抗病毒感染中发挥重要作用。 因此 , 中和抗体是一种具有很好应 用前景的抗病毒治疗制剂。 但是 , 采用小鼠单克隆抗体技术制备的抗病毒中和抗体对于人或畜禽等动物 存在异源性等特性 , 导致其临床应用受到限制。 近年来 , 随着抗体制备技术的发展 , 制备人源或动物源的中和抗体成为研究热点。 目前 , 针对人类免疫缺陷病毒、流感病毒、埃博拉病毒、登革热病毒等多种 病毒的全人源中和抗体开发取得了显著进展 , 而且还发现人体内可能存在具有抗 病毒中和作用的天然中和抗体。相对于人源中和抗体研究 , 猪等动物源中和抗体 的开发尚处于起步阶段。 猪繁殖与呼吸综合征（ Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（ PRRS Virus,PRRSV）引起的妊 娠母猪繁殖障碍、仔猪严重呼吸系统症状和生长迟缓等临床表现的病毒性传染病。 PRRSV感染或免疫能诱发很强的体液免疫反应 , 一般于感染后 7sup9/sup d 可检测到特异性抗体 , 但这些抗体对体内、外的病毒都没有中和能力甚至会增强 感染 , 而有效的中和抗体一般出现于 28 d 以后。 由于中和抗体产生的时间晚、水平低 , 使该病的防治十分困难。为深入研究 猪对 PRRSV的抗体反应 , 本研究利用噬菌体展示技术构建了猪源抗体库 , 并从中 筛选到具有中和能力的抗体。 进一步研究发现筛选到的中和抗体为多反应性抗体 , 主要结合细胞蛋白 KRT8（Keratin 8 ）和 MYH9（Nonmuscle myosin heavy chain II-A ）。具体研究 内容如下 :1. 猪源天然抗体库的构建与抗 PRRSV抗体的筛选分离 PRRSV抗原、抗 体阴性猪的 PBMCs（ Peripheral Blood Mononuclear Cells ）, 提取 mRNA,利用 RT-PCR技术扩增得到抗体重链可变区 （VH）、轻链可变区（ VL）基因 , 通过 overlap PCR将 VH、VL 用一条柔性多肽基因组装成 scFv（single-chain antibody ）片段。 噬粒 pComb3XSS与 scFv 片段经 Sfi I 酶切、回收、连接、电转化感受态细 , 获得库容为 1.5 ×10sup8/sup的初级库 , 经鉴定插入片段大小的正确率为 80%。通过测序发现 VH序列的相似度介于 63.3%sup9/sup2.5%,未发现相同序列 , 说明抗体库的多样性好。 IMGT数据库比对发现天然库 VH基因家族的分布符合文献报道的最多的 3 个基因家族占比 gt;40%, 最多的 6 个基因家族占比 gt;70%的规律 , 而且天然库 VH基因分布于 13 个不同的基因家族 , 进一步证实构建的天然库具有很好的多样性。加入辅助噬菌体超感染获得重组噬菌体抗体库 , 用纯化的 PRRSV病毒粒子进行筛选 , 获得 4 株噬菌体抗体 N-28、N-36、N-48、N-67。 将获得的抗体基因连接至 pET-22b 表达载体 , 经鉴定重组蛋白主要以包涵体 的形式表达。对包涵体进行变性、复性后 , 测定了 4 株抗体中和 PRRSV的能力 , 发现其中 N-28、 N-67 具有一定的中和 PRRSV的能力。 猪源 PRRSV免疫抗体库的构建与抗 PRRSV抗体的筛选为筛选具有广谱抗 PRRSV的中和抗体 , 首先用 PRRSV商品化弱毒活疫苗免疫 30 日龄仔猪 , 然后用高 致病性 PRRSV毒株（ WUH3株）、两种美国流行毒株（ VR2385、VR2549）、国内分 离的流行毒株（ NADC30L）对仔猪进行感染。经过 8 次免疫 / 感染后 , 实验猪体内 产生了针对 PRRSVWUH3株、VR2385株、 VR2549株和 NADC30L株的高滴度中和抗 体 , 中和效价介于 1∶63.5sup1/sup ∶858.7 之间。 分离高免疫猪的 PBMCs,扩增抗体基因 , 经过多次电转获得库容为 2× 10sup7/sup的初级库 , 经鉴定插入片段大小的正确率为 89.4%。通过测序发 VH序列的相似度介于 70.3%sup9/sup3.5%,未发现相同序列 , 说明免疫抗体库的多样性好 ;VH 基因家族则由天然库的 13 个下降为 6 个, 说明经过多次免疫 感染后试验猪的抗体基因使用率发生了明显的变化。 用纯化的 PRRSV病毒粒子对构建的抗体库进行富集、筛选 , 最终获得 3 株噬 菌体抗体 I-2154