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玉米抗粗缩病主效 QTL的定位、克隆和应用 玉米 (Zea Mays L.) 是我国第一大粮食作物 , 在我国粮食和能源安全保障体系 中占有极其重要的位置。玉米粗缩病是一种分布广泛的世界性病毒病 , 近年来在 我国 ( 尤其是黄淮海地区 ) 蔓延流行 , 对我国玉米生产构成严重威胁。 发掘抗病基因、培育抗病品种 , 从遗传上解决玉米粗缩病问题是最经济有效 的途径。本研究以来源于杂交种 CL1165的 50 份 F9 代杂合自交家系 (Heterogeneous inbred families,HIFs) 为主要实验材料 , 开展玉米抗粗缩病主 QTL位点的定位、克隆和应用方面的研究 , 具体结论如下 :1 、在山东省济宁、肥城和泰安三个地点连续三年 (2008 、2009 和 2010 年 ) 对这 50 份 HIFs 材料进行 粗缩病抗性鉴定 , 筛选出 24 份在不同年份和地点间抗性稳定的材料 , 包括 9 份感 HIFs 和 15 份抗病 HIFs。 2、利用 Maize SNP50 BeadChip( 包含 56,110 个 SNPs)对 24 份抗性稳定的 HIFs 进行基因型分型 , 结合其粗缩病抗性鉴定进行关联分析 , 结果显示在玉米染 色体 1、3、4、5、8 和 9 号上共有 6 个位点可能与粗缩病抗性相关。 3、筛选粗 缩病敏感 (NT401和 NT411)和抗病 (NT399和 NT409)的 HIFs, 分别组配成 485个 BC2 家系和 211 个 BC1F2家系 , 于 2011 年进一步验证这 6 个候选位点 , 结果表明位于 bin8.03 的抗病位点 ,qMrdd1, 为主效隐性抗病 QTL,覆盖约 15Mb的区域。 4、2012 年, 对来源于 101 个 BC1F3代重组个体的 6,708 个 BC1F4后代植株 进行基因型分型和粗缩病抗性鉴定 , 利用重组后代测验法将 qMrdd1 精细定位到 1.2Mb 的区域内。 5、2013 年 , 对来源于 21 个 BC1F5重组个体的 2,238 个 BC1F6 后代植株进行基因型和粗缩病抗性鉴定分析 , 连续精细定位 , 最终将 qMrdd1 精细 定位到 201,335bp 的区域内。 6、从黄 C(感病 ) 和 X178(抗病 ) 的 921 个 F6 代重组自交系 (Recombinant Inbred Lines,RILs) 中, 筛选出 200 份核心 RILs 和 155 份在 qMrdd1 区域发生交 换的 RIL 材料 , 在泰安、济宁、肥城三点进行粗缩病抗性鉴定 , 并进行基因型数据 分析。对核心 RIL 材料的分析显示抗病 X178 中同样含有玉米抗粗缩病 qMrdd1 位点 , 分析 qMrdd1 区域的交换 RILs 将 qMrdd1 定位到 306,554bp 的区域内。 7、整合两个群体的定位结果 ,qMrdd1 最终被限定到 201,335 bp 的区域内 , 我们从抗病材料 1145 的 BAC文库中筛选出覆盖该区域的 BAC克隆。通过阳性 BAC 的测序、基因预测 , 与 B73 序列的比对 , 最终确定了一个候选基因。 隐性的抗病等位基因是由一个 Helitron 转座子插入造成的。 8、借助于 RACE 技术 , 我们获取了候选基因的全长 cDNA序列 , 发现该基因有两个转录本。 针对这两个转录本我们分别构建过表达载体 , 同时也构建干扰载体。目前已 经获得过表达转基因 T0 代植株。 根据抗感材料中各两个转录本的序列信息 , 预测分析显示四种蛋白均定位于 细胞质 ; 同源建模分析显示抗感材料中蛋白高级结构存在显著差异。 9、根据该候 选基因的 DNA序列特征 , 我们开发出基因特异的诊断标记 , 可用于分子标记辅助 选择。 在收集的 53 分自交系材料中通过关联分析显示转座子插入与粗缩病抗性显 著相关。检测 739 份自交系、 334 份农家种和 192 份大刍草材料 , 结果显示有 18 份自交系和 1 份农家种材料存在该 Helitron 转座子的插入。 测序分析显示 Helitron 转座子的序列和插入位置完全一致 , 表明该转座子 插入为大刍草驯化成玉米之后的一个突变事件。 10、利用分离群体研究显 示 ,QTL-qMrdd1(M103-4 和 M113-6 之间 9.97Mb)对玉米的株高、顶端节间长、开 花期、吐丝期和抽雄期等无不良影响。 利用分子标记辅助选择 , 我们对黄淮海地区的 6 个骨干自交系进行粗缩病抗 性改良。