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帕金森病细胞损伤模型论文 【关键词】肉苁蓉；1甲基4苯基 吡啶离子；帕金森病；生存率 帕金森病(Parkinson sdisease,PD )是中枢神经系统进行性变性疾 病。一旦出现临床症状，其黑质纹状体系统多巴胺神经元已经减少了 60%-80%尽管神经科学家采取包括左旋多巴制剂在内的各种治疗方 法，但目前所有的研究都提示无法阻止其进展。 生长抑制和DNA损伤 诱 导 基 因 153 (垃inducedgenel53］ GADDI53 )是调控 细胞凋亡的一种重要蛋白，在细胞内质网应激等应激状态下大量表达 并转位于细胞核］1］。本研究观察了肉苁蓉提取物对 1甲基4 苯基 吡啶离子(1 meLhyl 4 phenylpyfidiiiiumicm, MPP )介导 的\H 多巴胺能细胞系损伤的保护作用及对 GADD15表达的影 响，并探讨了其对帕金森病的神经保护作用。1材料与方法1.1材料 肉苁蓉提取物，上海市东方科技公司产品，PBS稀释成10mg/ml,22^ m 滤膜过滤灭菌；MPP+ Sigma公司产品，无菌蒸馏水稀释成4mol/L ; 胎牛血清、达尔伯克改良伊格尔培养基 (Dulbecco smodifiedeagle smediumQMEM 胰蛋 白酶，均为Gibco公司产品；GADD15小鼠抗人单克隆抗体，SantaCruz 公司产品；小鼠抗人B Mtiri单克隆抗体，Sigma公司产品；甲基 噻唑基四唑(methylthiazolyltetrazolium,MTT ),荷兰 Duchefa 公 司 产 品； 反 转 录 试 剂 盒 (reasEl炮lscripME polyniefBSEC.hain匸叙ligRT PCR ), MBI公司产品；SH SY5Y细胞，复旦大学神经生物学国家重点实验室 黄芳老师惠赠。1.2实验方法1.2.1细胞培养及分组5H SY5Y细胞 每2?3d用10%DME培养液换液1次。待细胞增长至80%融合时，用 0.25%胰酶消化细胞，按1X 105分瓶传代，置于5%CO2勺细胞培养箱 中。实验用细胞分为对照组、MPP组和肉苁蓉提取物不同浓度组。用 DME培养液将MPP按1 : 10梯度稀释成400mmol/L,按1 : 100体积 比例加入96孔板或6孔板中，使MPP终浓度分别为0.25、0.5、1、 2和4mmol/L。肉苁蓉提取物用 DMEM培养液按1 : 10梯度稀释成 1mg/ml与10卩g/ml两个工作浓度。按1 : 100加入96孔板或6孔板 中，使终浓度分别为1、10和100卩g/ml。6孔板每孔总体积为2ml, 96孔板每孔总体积为200卩l。每项相同实验均重复3次。1.2.2MTT 检测细胞活性1.2.2.1MPP+对、H SY5Y细胞存活率的影响1X 104密 度、H SY5Y细胞200卩l接种于96孔板，24h后换含MPP终浓度分 别为0.25、0.5、1、2和4mmol/L的培养液，每浓度3复孔，置于 5%CO培养箱37C孵育，分别于6、12、24和48h时各孔加入MTT2@ l , 继续孵育 4h取出培养板。吸弃培养液，每孔加入二甲基亚砜 (dimethylsulphoxideQMSO ) 150l 充分震荡 10min,待蓝色颗粒 完全溶解后用全自动酶标仪(Biorad产品)570nm处测定吸光度值。 1.2.2.2肉苁蓉提取物对mpp介导的5H SY5Y细胞损伤的影响终浓 度1mmol/LMPP与肉苁蓉提取物分别为1、10和100卩g/ml同时加入 96孔板置5%CO2培养箱37C孵育48h。其余步骤同 1.2.2.1。 1. 2. 3RT卩CR检测GADD153勺mRNA表达终浓度1mmol/LMPP与肉苁 蓉提取物分别为1、10和100卩g/ml，同时加入6孔板置5%CO培养 箱37C孵育48h。取出6孔培养板，PBS冲洗，按Trizol法提取总 RNA取1卩gRNA按反转录试剂盒说明进行逆转录。聚合酶链反应 总体积为25卩I。引物序列为：GADD153上游引物，5 GCACCTCCCAGAGCCCTCACfCTCC 3 ；下游引物，5 GTCTMTiX血GCCTTOBXTGCG 3 p ^rin 上游引物，5 ATCGTGGGCCGdCTAX汇 3 ；下游引物，5 TGGCCTTAGGGTTCAGAGGGGC 3。扩增目的产物的长度分别为422bp 和244bp。94C预变性5min。循环参数为：95C变性0.5min , 60C 退火0.5min , 72C延伸1min,共35个循环。取PCR产物4卩l，电 泳后拍照。1.2.4Westernblotting 检测 GADD153蛋白表达终浓度 1mmol/LMPP与肉苁蓉提取物分别为1、10