分子生物学：细胞培养.ppt

细胞培养 基本概念 是在无菌的条件下将活器官、组织或细胞置于培养基内，并放在适宜的环境中，进行连续培养而成的细胞、组织或个体。这种技术已广泛应用于农业和生物、医药的研究。 　　美国在20世纪中期应用组培技术而获得的芹菜苗已成苗地取代了种子繁殖的传统方法。我国目前在番茄、辣椒、马铃薯、生菜、人参和果品生产中也已广泛投产应用。 细胞系：原代细胞经第一次传代后，形成的细胞群体，即具有增殖能力，类型均匀的培养细胞，一般为有限细胞系。 细胞株：细胞系经过克隆或其他方法而得的单一类型的细胞群体。 原代培养后得到细胞系，再经多次传代培养后，一部分细胞死亡，一部分细胞继续生长并转化为连续细胞系或无限细胞系。 概念 细胞培养的种类 贴壁培养：大多数上皮样细胞，呈梭型，伸脚， 悬浮培养：白血病细胞，小鼠肝癌细胞在小鼠腹水中培养 三维培养：三维又可分为普通三维培养和立体三维培养， 包括凝胶三维培养，凝胶胶滴三维培养（CD-DST）， 三维支架培养等。 三维立体培养更贴近于生物体内的生理情况，对肿瘤药敏和发生 机理等的研究效果更好。 实时监控 ：动态观察 常用细胞株的种类 各种肿瘤细胞株：如肝癌，乳腺癌等 正常细胞株：永生化的，Chang liver ,L-O2 NIH3T3: 小鼠纤维母细胞 包装细胞：包装病毒，293T, 杂交瘤细胞株：免疫的脾细胞+骨髓瘤细胞 = 融合细胞 胚胎干细胞 间充质干细胞 基本条件 细胞培养室：清洁的无菌间（紫外灯消毒） 仪器设备：超净工作台（配有刻度吸管，酒精灯，移液器，废液缸）， 二氧化碳培养箱，二氧化碳钢瓶，（荧光）倒置显微镜，液氮 灌，高压灭菌锅，冰箱，水浴锅，离心机，滤器（过滤培养基）, 细胞计数器 试剂：血清，培养基（1640，DMEM等)，PBS，胰酶（或EDTA)，抗菌素 器皿：铝饭盒，培养瓶，培养皿，6孔板，24孔板，96孔板，水桶 细胞株：贴壁，悬浮 动物细胞培养的特殊性 1、大多数哺乳动物细胞只有附着在固体或半固体的表面才能生长。 2、动物细胞对于营养要求更加苛刻，除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，还需要血清。 3、对于培养环境的适应性更差，对环境极其敏感，包括 pH 、溶解氧、温度、剪切力等都比微生物有更高的要求，一般需严格监控。 4、动物细胞生长缓慢，因此培养时间较长。对环境的影响又比微生物为大，因此常用空气、氧、二氧化碳和氮的混合气体进行供氧和调节pH。  培养细胞的生存环境 1.环境无毒和无菌；2.适宜的温度；人和哺乳动物培养细胞最适温度均为35－37℃。3.气体环境和氢离子浓度；需要一定量的O2（1995－9975pa）和CO2（95％空气+5%CO2）；pH7.2-7.44.渗透压；260－320mOsm/kg适用于大多数细胞5.营养物质；六碳糖是主要的能源物质，还需要12种基本氨基酸和谷胺酰胺等 细胞培养方法 原代培养：细胞第一次贴壁，未成细胞系 有组织块法，胰酶消化法（单细胞） 传代培养：细胞从培养瓶上脱离，第二次再贴壁；或消化后再贴壁 培养基：含10%血清培养液（完全培养基）+抗菌素 （常用1640，DMEM) 冻存：在液氮中长期储存（缓慢），-20度1小时，-80度过夜，液氮 DMSO占10%+含一瓶细胞的10%血清培养基占40%+血清占50%=1ml 冻存管 复苏：液氮中取出后快速复温（37度水浴），减少震动 细胞运输： 无菌技术 所有器皿需要高压灭菌 操作需要无菌 培养基过滤除菌 胰酶过滤除菌 培养基中加入抗菌素 细胞离心：速度800-1000转/分 换液与传代：2-3天换液一次（培养液变黄），2-4天传代一次（细胞长满） 细胞污染 培养基变浑浊——废弃，清理孵箱 防止细胞交叉污染：更换吸管 细胞培养的应用——体外观察基因的功能 检测细胞增殖能力：MTT, BrdU, EdU, 流式细胞术 检测细胞凋亡：检测形态学及细胞膜完整性的Hoechs-PI双染色法， 检测细胞膜成分变化的Annexin V 联合PI法 原位缺口末端标记技术（in situ end labelling technique，ISEL），即TUNEL法 细胞迁移能力：划痕实验，Byden’s Chamber 细胞侵袭能力：Transwell侵袭实验 细