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重组体分子的科学选择与鉴定方法 重组体分子的科学选择与鉴定方法 重组体分子的选择与鉴定方法及原理 重组体分子的科学选择与鉴定方法 重组体分子的选择与鉴定方法 我们把外源基因导入受体细胞的目的是获得带有目的基因 阳性重组体，因而重组体的筛选是体外重组技术的一个重 要环节。 涂布菌液，观察平板是无法判断重组子是否是我们所需的。 因此，我们需要进一步进行筛选。 常用的筛选方法概括起来有两大类：①直接筛选法；②间 接筛选法。 重组体分子的科学选择与鉴定方法 直接筛选法 直接筛选法是借助遗传学表型来进行筛选的方法。 重组子转化宿主细胞后，载体上的一些筛选标志基因表 达，会导致宿主的某些表型的改变，通过琼脂平板中添加 相应筛选物质，可以直接筛选含重组子的菌落。如果质粒 上有两种抗性，因为外源基因的插入，导致其中一个不能 表达，那么也可以通过抗药性将重组子筛选出来。 重组体分子的科学选择与鉴定方法 间接筛选法 间接筛选法是检测重组体克隆中是否含有目的基因的核苷 酸序列或是否产生目的基因所编码的产物。 一般来说，先用直接筛选法进行初步筛选后，再用间接检 测法进行鉴定，直至获得我们所需要的阳性重组体。 重组体分子的科学选择与鉴定方法 DNA水平 RNA水平 蛋白质水平 遗传表型直接筛选法 核酸分子杂交法 PCR法 DNA序列分析法 直接凝胶电泳法 酶切片段分析法 重组子筛选 检测特定外源基因是否转录及转录的强度 （Northern杂交印迹法) 免疫化学检测法（放射性抗体检测法、 免疫沉淀检测法） Westhern印迹杂交法 重组子筛选的方法 重组体分子的科学选择与鉴定方法 重点介绍的筛选方法 间接选择法 抗药性筛选 a互补 快速裂解菌落鉴定分子大小 限制性内切酶酶切法 PCR方法筛选鉴定重组子 遗传表型直接选择法 菌落杂交筛选 重组体分子的科学选择与鉴定方法 遗传学表型筛选的方法之一——抗药性筛选 基本原理 抗药性筛选主要用于重组质粒DNA分子的转化子的筛选。 因为质粒DNA携带有特定的抗药性选择标记基因，与目的 基因重组后，转入受体菌，能使受体菌带有相应抗药性， 另一种情况是虽然质粒中原来有相应抗性，但插入外源片 段后重组质粒失去抗药性，据此我们也可以进行抗药性筛 选。 重组体分子的科学选择与鉴定方法 常用的抗药性选择标记 抗药性 溶解剂 虑过除菌 贮存温度 贮存浓度 终浓度 氨苄青霉素（Amp） 氯霉素（Cm） 水 乙醇 是 否 -20℃ -20℃ 50mg/ml 34mg/ml 50~100μg/ml 20~170μg/ml 卡那霉素（Ka或Kan） 水 是 -20℃ 10mg/ml 50μg/ml 四环素（Tet或Tc） 乙醇 否 -20℃ 12.5mg/ml 10μg/ml（液） 12.5μg/ml （固） 链霉素（Sm或Str） 水 是 -20℃ 20mg/ml 25μg/ml 重组体分子的科学选择与鉴定方法 A 如果外源基因片段插入载体的位点在抗药性基之外， 不导致抗药性基因的失活，仍能编码抗药性基因产物。 含有这种重组子的转化细胞可以在含有相应抗生素的琼 脂平板上生长成菌落，未能接受载体DNA的细胞因不能 生长而被排除。 b：如果外源基因片段插入载体的位点在抗药性基因中 间，导致抗药性基因失活，这个抗药性标志就会失活。 检测外源DNA插入作用的一种通用的方法是插人失活 效应 。 重组体分子的科学选择与鉴定方法 重组体分子的科学选择与鉴定方法 a类筛选 基本原理 抗药性筛选主要用于重组质粒DNA分子的转化子的筛选。 因为重组质粒DNA携带有特定的抗药性选择标记基因，转 化受体菌后能使后者在含有相应选择药物的选择培养基上 生长，而不含重组质粒DNA分子的受体菌则不能存活。 重组体分子的科学选择与鉴定方法 a类筛选的实验方法 LB固体培养基中加入千分之一的抗性药物，再倒平板； 将转化后的菌液均匀涂布在平板上； 放在37℃培养箱培养12~16小时； 观察菌落生长情况。 重组体分子的科学选择与鉴定方法 抗药性标记法示意图 重组体分子的科学选择与鉴定方法 b类插入失活筛选 从原理上讲，当