肿瘤细胞培养方法和培养基.docVIP

肝癌细胞培养 一、 培养基 1、 RPMI-1640+10%胎牛血清培养基 2、 DMEM+15%胎丁血清培养基 成分表 培养基成分： 成分 PRMI-1640(mg/L ) DMEM(mg/L ) 精氨酸 200 84 天冬酰胺 50 — 天冬氨酸 20 — 胱氨酸 — 48 半胱氨酸 50 — 谷氨酸 20 — 谷氨酰胺 300 584 甘氨酸 10 30 组氨酸 15 42 轻脯氨酸 20 — 异亮氨酸 50 104.8 亮氨酸 50 104.8 赖氨酸 40 146.2 蛋氨酸 15 30 苯丙氨酸 15 66 脯氨酸 20 — 丝氨酸 30 42 苏氨酸 20 95.2 色氨酸 5 16 酪氨酸 20 72 绻氨酸 20 93.6 生物素 0.2 — 偏多酸钙 0.25 4 氯化胆碱 3 4 叶酸 1 4 肌醇 35 7.2 菸酰胺 1 4  ?氨?苯甲酸 1 — 毗哆醛 — 4 毗哆醇 1 — 核黄素 0.2 0.4 硫胺 1 4 维生素b12 0.005 — CaCL — 200 Ca(NO3)2-4H2O 100 — Fe(NO3)3-9H2O — 0.1 KCI 400 400 MgSC4 48.8 200 NaCI 6 000 6 400 NaHCO3 2 000 3 700 NaH2PO4H2O — 141.3 Na2HPO4 800.7 — 匍萄糖 2 000 4 500 酚红 5 15 丙酮酸盐 — 110 HEPES 5 958 — 二、 实验前准备工作： 操作者的皮肤、培养瓶的盖和外壁常用酒精消毒。用紫外线消毒实验室空气、工作台血和一 些不能使用其他方法消毒的培养器肌。进无菌室前或做完实验后，均应开灯照射30min进 行消毒。紫外线照射60min可以消灭空气屮大部分细菌。 1、玻璃器皿的清洗火菌（5%盐酸溶液、重鉛酸钾120ml、硫酸200mK蒸憎水200ml）： （1） 浸泡:新使川或重复使用的玻璃器血须经5%盐酸溶液或自来水浸泡过夜或煮沸30min, 水洗。以去除新购进玻璃器皿所带有灰尘、铅、碑等物质，并消除其弱碱性。 （2） 刷洗:浸泡后用软毛刷和优质的洗洁精进行刷洗。刷洗后经行烘干。 （3） 酸浸:刷洗后的玻璃制品酸浸前须适当晾干或烘干，以免造成酸浸液稀释，煤响效果。 将玻璃制品完全浸泡入清洁液中24h。清洁液具有极强酸蚀作用，操作过程需戴防护用具。 （4） 冲洗、烘干备用:浸酸后的玻璃器1111先用自来水充分冲洗，吸管需冲洗lOmin,器111L需 毎瓶灌满自来水、倒掉反复10次以上，不留任何酸浸液残迹，然示用蒸镭水漂洗2?3次, 将清洗好的玻璃器川L放入烘干箱屮，烘干示的玻璃器川L要求干净透明，无汕烟，不能残留任 何有害物质及化学药品等。 （5） 包装火菌:器材经清洗烤干或晾干后，先应严格包装，然后再行消毒火菌处理，以防止 消毒灭菌示再次遭受污染。包装材料常川包装纸、牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、玻璃或 金属制吸管筒、纸绳等。 2、 橡胶制品清洗消毒： 0.5mol/L NaOH煮沸15分钟，流水冲洗,0.5mol/LHCI煮沸15分钟，流水冲洗,自来水煮沸 2次，蒸幅水煮沸20分钟，50°C烤干备用 3、 塑料制品的清洗消毒（瓶盖、离心管）： 使用器皿后立即用清水清洗，浸于H来水过夜，用纱布或棉签和50°C清洗液刷洗，流水冲 洗，晾干，浸于清洁液15分钟，流水冲洗（15 — 20遍），蒸馆水浸洗三次，双蒸水泡24小 时，晾干备用。 三、 细胞复苏： 冻存细胞保存管保存在液氮屮（＜L96°C）,取出保存管麻必须快速冷冻，以避免冰晶重新结 晶而对细胞造成伤害，致使细胞死亡。在冻存细胞的保存管屮含有对细胞有毒害的成分 DMSO,故在解冻应马上将其去除。在冷冻活化前应在无菌台上将细胞培养液配好，然品将保 存管从液氮中取岀，放于37°C的温水小快速使细胞解冻。解冻后悬液快速移入培养液中混 匀，离心去掉上清液，再加入细胞培养液。 实验人员穿上无菌实验室操作服用酒精喷于手上消毒，然示就位用酒精棉球擦拭实验台 （1） 取一 15ml离心管用滴管在其内滴加5-9ml培养液（取8ml）。 （2） 从液氮罐屮取出冻存管，并迅速放入37°C水浴，不时摇动，使其急速融化，30?60s 内完成。 （3） 冻存管用70%酒精擦拭消毒后，打开盖了，用吸管将细胞悬液转移入上述离心管屮（川 培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来）。 （4） 低速离心（1000r / min） 5min,去上清后再用8ml培养液再清洗离心一次。 （5） 离心后倒掉上清液,在离心管中滴加3ml培养液（RPMI-1640）,混匀（可用滴管轻柔 吹打）。 （6） 将离心管中的混合液转移到培养瓶中，并在培养瓶屮滴加15滴10%小牛血清