昌黎、银川产区酒酒球菌遗传多样性分析及优良菌株筛选.docxVIP

昌黎、银川产区酒酒球菌遗传多样性分析及优良菌株筛选 酒酒球菌 (Oenococcus oeni,O.oeni) 是苹果酸 - 乳酸发酵 (malolactic fermentation,MLF) 的主导菌 , 是葡萄酒最终质量风格 的塑造者之一。法国、西班牙、意大利、澳大利亚、阿根廷和智利等 发达的葡萄酒生产国非常重视对酒酒球菌进行遗传多样性的研究 , 进而开发利用本土优良酒酒球菌。而在我国不同葡萄酒产区 , 基于菌株水平进行的酒酒球菌遗传多样性及筛选本土优良发酵菌株等方面的研究 , 仍较为匮乏。因此 , 本研究同时应用荧光标记扩增片段长度多态 性(amplified fragment length polymorphism,AFLP) 技术和基于看家基因建立的多位点序列分型 (multilocus sequence typing,MLST) 技术 , 对分离自中国不同葡萄酒产区的酒酒球菌开展遗传多样性研究 , 并对其分型能力进行评估。选择更为高效的遗传分型技术 , 对具有中国“葡萄酒原产地保护区” 的代表性产区——昌黎产区和宁夏银川产 , 进行酒酒球菌的遗传分型及多样性分析 ; 随后 , 建立三级筛选优良菌株体系 : 采用 specific-PCR 技术 , 通过功能基因鉴定 , 实现对分离本土酒酒球菌的快速、 精准的初步筛选 ; 经抗胁迫能力评估 , 得到复筛菌株 ; 最后研究不同菌株的酿酒风格特色 , 从而筛选出适用于我国特色葡萄酒酿造的本土优良酒酒球菌。 试验结果如下 :(1) 采用荧光标记 AFLP技术和 MLST技术 , 对分离自我国不同产区的 38 株酒酒球菌进行遗传多样性及其种群结构的研究。 结果表明 , 荧光标记 AFLP技术显示了强有力的遗传分型能力 , 得到 37 个 AFLP型, 其分辨系数高达 99.9%; 而采用 MLST技术获得 7 个 ST(sequence type,ST) 型, 其分辨系数仅 60.2%。在种群遗传结构分析上 , 荧光标记 AFLP技术和 MLST技术均可将试验菌株可以区分为 2 个亚种群结构 , 且种群结构成分相近。在 MLST中, 经生物信息学分析构建最小生成树 (minimum spanning tree), 发现这 2 个亚群呈现典型的克隆复合体结构 ; 基于 SplitsTree 的重组分解分析 , 基因内及基因间不存在遗传物质的重组 , 进一步揭 示了分离自我国不同产区的酒酒球菌是典型的克隆型种群结构特征。 这些结果可以为我国本土酒酒球菌的遗传多样性分析提供理论依据 及方法支持。 (2) 采用 Species-specific PCR及荧光标记 AFLP技术 , 对我国首批 “葡萄酒原产地保护区” 昌黎产区不同酒庄的酒酒球菌进 行分离鉴定及遗传多样性研究。结果表明 : 荧光标记 AFLP技术可将 222 株 O.oeni 分为 221 个 AFLP遗传型 , 其相似性系数在 74~98%,表明 该产区酒酒球菌遗传多样性丰富。基于非加权配对算术平均法 (unweighted pair group method with arithmetic means,UPGMA) 进行聚类分析 , 在 81.7%的相似性水平上 , 分离菌株存在 2 个主要的结 构类群。极其重要的是 , 在种群遗传发育上 , 分离自同一酒庄的 O.oeni 菌株种群形成了独特的簇群结构 , 呈现出种群遗传结构和分离来源的 典型特异性关系。 (3) 采用 Species-specific PCR 及荧光标记 AFLP 技术 , 对产自我国银川产区的赤霞珠葡萄酒和蛇龙珠葡萄酒中酒酒球 菌进行分离鉴定及遗传多样性研究。 结果表明 : 荧光标记 AFLP技术可 将筛选的 207 株 O.oeni 分为 206 个 AFLP遗传型 , 其相似性系数在 63~97%,表明该产区内酒酒球菌在菌株水平存在较高水平的遗传异质 性。基于 UPGMA进行聚类分析 , 在相似性系数为 79.88%水平上 ,207 株 分离株呈现出清晰的 A、B 和 C三个结构类群。其中 , 相似性水平为81%的 A 和 B 类群是最主要的结构类群 ; 有趣的是 , 它们分离自不同的酿酒品种。这表明 , 在不同的酿酒葡萄品种上 , 蕴含着丰富的酒酒球菌微生物资源 , 且存在明显的种群结构差异。 (4) 挑选分离自我国的本土酒酒球菌 , 采用 specific-PCR 技术 , 对分离菌株进行功能基因的鉴定 , 从而对具有潜在优良发酵特性菌株实现精准、 快速地初步筛选。 结果 表明 , 挑选的 170 株酒酒球菌菌株均具有影响葡萄酒感官质量风格和 抗胁迫相关的优良基因 bgl 、estA 和 gshR; 与氨基甲酸乙酯生产紧密关联的