细胞工程6原生质体培养和植物体细胞杂交.pptVIP

* * 两个不同亲本的原生质体混合后经诱导融合，实际上得到的是各种原生质体的混合物，包括异核体（heterokaryon）、同核体（homokaryon）以及未发生融合的双亲原生质体。 如果是细胞质发生融合而细胞核未融合，两个核处在共同的细胞质中，则形成异核体或异核细胞（heterokaryocyte）。如果双核异核体的细胞核也发生融合，就会产生真正的杂种细胞。异核体中的两个细胞核，若亲缘关系太远，其中一个核中的染色体会一个个被排除掉，形成不对称杂种（asymmetric hybrids）；如果整个核完全消失，但细胞质依旧是杂合的，这种融合产物叫胞质杂种（cybrid）。若两个相同原生质体发生融合，则形成同核体。 ----在经过融合处理的原生质体群体中，既有未融合的亲本原生质体 也有同核体、异核体和各种其他的核-质组合； ---- 异核体是杂种的来源，虽然有报道说其发生频率可高达50%，但 多数情况下，它们在原生质体混合群体中只占约0.5%～10% ，且随着培养时间的延长，杂种细胞系的数目还会进一步减少； 因此，体细胞杂交中最重要的是鉴别和选择出杂种细胞。 * * 2、根据原生质体形态机械分离杂种原生质体----机械选择法 利用两种原生质体的某些可见标志，如形态色泽上的差异等对融合产物进行鉴别，在其可辨特征消失之前，将融合的细胞从混合群体中挑选出来进行单独培养，这一方法称为机械选择法，可分为两种： （1）利用天然颜色标记分离杂种细胞 （2）利用荧光素标记分离杂种细胞 利用天然颜色标记和双重荧光标记机械挑选杂种细胞，由于显微操作费工费时，选择出异核体的量少，其应用具有一定局限性，要获得大量的杂种植株比较困难； 利用双重荧光标记并应用荧光激活细胞分选仪自动分离杂种细胞既准确，效率又极高，大约每秒钟可分离5x103个，是一种较有前途的方法，但仪器昂贵。 * * 利用融合双亲原生质体在生理和遗传特性上的互补性进行杂种细胞筛选。所用生理和遗传特性包括生长互补、营养缺陷型互补、白化突变与野生型互补、抗性差异性互补、雄性不育与雄性可育型互补、隐性非等位基因互补等。 * * 生长互补筛选法： 原理：根据融合双亲原生质体及其同源融合体和杂种细胞对培养基中外源激素需求性的差异，淘汰双亲原生质体和同源融合体，保留杂种细胞以达到选择的目的。其本质在于双亲原生质体和同源融合体缺乏合成某种内源生长激素的能力，而体细胞杂种由于互补作用可以合成该生长激素。 例证：如Carlson等于1972年获得的第一个植物体细胞杂种就是采用该方法得到的。粉蓝烟草与朗氏烟草的原生质体在无生长素的培养基中均不能再生，但融合杂种由于生长互补性可产生内源生长激素从而能够在无生长激素的培养基中生长发育。 * * 营养缺陷型互补筛选法： 原理：主要是利用融合亲本原生质体和杂种细胞对某种营养物质需求不同的差异进行。该方法主要应用于微生物的遗传研究，高等植物中由于具有营养缺陷型的植物很少，因而只有在有限的范围内用来选择杂种细胞 例证：Glimelius等利用硝酸还原酶缺陷型突变体（NRˉ）在烟草原生质体融合中进行了杂种细胞的筛选。两个不同的NRˉ在以硝酸盐为唯一氮源的培养基中均不能生长，但二者的融合杂种由于生理互补，其NR活性得以恢复，可在该培养基中生长从而被选择。 * * 抗生素的抗性互补性差异筛选法： 原理：利用融合亲本原生质体对抗生素的抗性互补性差异进行筛选此法主要依赖于转基因技术获得对抗生素具有抗性的材料，并将此材料用于分离原生质体，再与不抗该抗生素的材料（大多数情况下具有再生能力）融合，通过抗生素抗性和再生能力互补即可筛选出体细胞杂种。 例证：Kaendler等采用一融合亲本的转基因系，该转基因系能够抗卡那霉素，但分离出的原生质体不能发育至细胞团或再生出植株，另一个融合亲本原生质体具有很好的再生能力，但在加有卡那霉素的培养基中不能生长。则在加有卡那霉素的培养基中，杂种细胞才能够生长并再生出植株。 * * 1、形态学观察：是最基本的鉴定方法，观察的内容主要有叶片、花的颜色、植株生长习性等形态性状。 2、细胞学方法：主要观察染色体的核型、染色体形态差异和进行染色体计数。 3、遗传标记法： ①同工酶 * * 体细胞杂种的特点： 形态上的趋中性 变异幅度大 非整倍性 双亲性状的共显性 偏亲现象 体细胞杂种的遗传特性： 1、细胞分裂与染色体丢失 体细胞杂种的遗传特性如果细胞分裂而核不发生融合，在以后的发育过程中就会有两种结果，一是细胞分裂几次以后即停止生长从而导致死亡；二是在发育过程中某一亲本的细胞核部分或是全部丢失。如此则会产生这几种情况：A细胞＋B细胞质；A细胞＋B细胞质和部分染色体或基因。 2、基