酶工程-3--酶的分离纯化.pptVIP

2021/3/14 * 2、亲和电泳 ——将亲和配体共价偶联于电泳凝胶上,由于亲和作用,待分离的酶与配体结合后，在电泳中不再移动，而其它杂蛋白不与配体结合，使目的酶分离出来。 2021/3/14 * 五、根据稳定性的差异建立的分　　离纯化方法　　—1、热变性法　　—2、酸碱变性法　　—3、表面变性法 2021/3/14 * 1、热变性法——根据目的酶与杂蛋白热稳定性差异,可以在较高温度下,使杂蛋白变性沉淀，而酶则保持可溶状态。 * * After the animation is complete, a question is posed, similar to the one in the Lab manual. The students need to realize that since the tubes marched in from the left the earliest fractions came off first. The left most peak is correct. Feedback will indicate that. Jim? What direction should we have the tubes march in. “It will probably take about 10 tubes before our proteins start coming out.” As the column runs, the bands will spread out further apart 2021/3/14 * 基本原理 蛋白质是两性电解质,在一定pH下,可解离成带电荷的离子，在电场作用下可以向与其电荷相反的方向的电极泳动，泳动速度主要取决于蛋白质分子所带电荷的性质、数量及颗粒的大小和形状。 2021/3/14 * 由于各种蛋白质的等电点（pI）不同,分子量不同,在同一个pH缓冲溶液中所带电荷不同，故在电场中的泳动速度也不同，利用此性质，可将混合物中不同蛋白质分离开，也可用其对样品的纯度进行鉴定。 2021/3/14 * 双向电泳-1 2021/3/14 * 双向电泳-2 2021/3/14 * 双向电泳-3 2021/3/14 * 电泳法（1）区带电泳（2）等点聚焦电泳（3）高效毛细管电泳 2021/3/14 * （1）区带电泳　——在惰性支持物上进行电泳时样品中各组分迁移速度不同而分布成区带的一类电泳分离方法　——按支持物的物理性状可分为3种类型:　　　—膜电泳 　　　—粉末电泳　　　—凝胶电泳 2021/3/14 * 膜电泳——以滤纸、聚酰胺薄膜,醋酸纤维薄膜等为支持物的一类电泳分离方法。 2021/3/14 * 粉末电泳——以淀粉、纤维素粉或硅胶粉等为支持物的分离方法。 2021/3/14 * 凝胶电泳——以聚丙烯酰胺为支持物,兼有分子筛效应。 2021/3/14 * 区带电泳的优点 分辨率较好 设备简单 操作方便 2021/3/14 * （2）等点聚焦电泳——利用两性电解质在直流电场中形成一个连续的pH梯度,样品中各种蛋白质在各自的等电点在相应的pH区段聚集而达到分离的目的。 2021/3/14 * 等电聚焦电泳 2021/3/14 * 高效毛细管电泳 毛细管电泳是在内径为25~100?m的石英毛细管中进行电泳,毛细管中填充了缓冲液或凝胶。 使用毛细管的一个优点是: 它减少了由于热效应产生的许多问题,因为管的孔径小，面积与体积之比大，这样可以提高热散失，有助于消除由于热引起的扩散增加而造成的对流和区带变宽，因此管中不需要加入稳定介质即可进行自由流动电泳。 2021/3/14 * 2021/3/14 * 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE）是以聚丙烯酰胺作为支持物的一种电泳方法。 PAGE方法成了研究蛋白质和核酸等大分子物质的重要工具之一. 2021/3/14 * 实践中可根据不同目的选择所需的类型。 一般单向PAGE多用于分离具有活性的生物物质, 而双向或梯度PAGE则宜用于较难分离鉴别的生物大分子物质。 如果在PAGE时加入适量十二烷基磺酸钠（SDS）可用于测定蛋白质的分子质量; 如果PAGE与等电聚焦相结合时,可用于分析蛋白质的等电点。 除这些用途外，PAGE还可用于制备少量的纯度高、有活性的生物大分子物质 2021/3/14 * 聚丙烯酰胺凝胶具有三维网状结构,电泳颗粒通过网状结构的空隙时受到摩擦力的作用,摩擦力的大小与样品颗粒的