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超滤管使用方法和注意事项 蛋白浓缩和换Buffer通常使用超滤管，常见MilliporeAmicon-Ultra-15超滤管（MWCO10kD）。也有其它型号 、不一样体积大小和MWCO超滤管可选，视目标蛋白分子量和浓缩前体积、浓缩目标体积而定。可反复使用，使用一次就扔掉太浪费。以下是个人总结使用方 法和注意事项。 1、选择适宜超滤管，关键考虑MWCO和浓缩体积，最常见是Ultra-15（10kD）。到底选择多大截留分子量比较适宜呢？10kDa、 5kDa、还是30kDa？通常应截留分子量不应大于目标蛋白分子量1/3，比如目标蛋白分子量为35kDa，就能够选择10kDa截留分子量超滤 管。若目标蛋白分子量为10kD左右，则能够用截留分子量3kD超滤管。认真阅读使用说明书，注意超滤膜对多种化学物质耐受程度有所不一样，表格中有。 2、新买来超滤是干燥，使用前加入MilliQ水，水量完全过膜，冰浴或冰箱里预冷几分钟。然后将水倒出，即可加入蛋白液，加入多少，以不超出管顶白线为准。操作要轻，加入蛋白液前，超滤管需要插在冰上预冷。 3、平衡。质量和重心二者全部要达成平衡。注意转速和加速度不可太快，不然直接损坏超滤膜。开始离心超滤（离心机预冷至4度）。不一样离心机转速 rpm换算成g以后，有所不一样。具体可参阅附件里说明书。离心机加速度调至最低级，减小对膜压力。注意，一定要等离心机达成目标转速以后，方可离开 离心机，不然离心机出问题时，无法第一时间处理，后果不可估计！膜和转轴方向根听说明书调整（角转离心机情况是膜和轴垂直）。在实际使用中，通常转速 开比说明书里要低，这么能够延长离心管使用寿命。 4、当浓缩到剩下1ml时，【取50ul国产Bradford溶液，加入10ul流穿，看有没变蓝色，以此判定超滤管是否遗漏蛋白。假如管漏了，将 上层和流穿重新倒入新管中开始超滤。要正确判定是否漏管，用5mg/mlBSA离心10min，再取流穿，跑蛋白胶或Bradford粗测】，继续加入 剩下蛋白液浓缩（在冰上操作，预防蛋白受热），直到全部浓缩液全部加完为止。离心过程中注意是否发生蛋白沉淀，造成堵管。若发生沉淀，要确定沉淀具体原 因，是蛋白浓度过高还是Buffer不适宜；前者可用多根超滤管同时超滤，降低浓度措施处理，后者方法是换不一样Buffer，直到蛋白不发生沉淀为 止。 5、前面几步用以浓缩蛋白，假如要换Buffer，在总蛋白液浓缩至1ml左右时候，轻轻加入新Buffer（经0.22um超滤膜超滤），再 浓缩至1ml左右，连续三次，最终一次浓缩终体积依据需要蛋白浓度而定，通常不多于500ul，也有浓缩至200ul以内情况。根据每次最少10倍 左右体积浓缩算，三次达成1000倍以上，基础上能够达成换buffer目标。 6、取出最终蛋白浓缩液操作在冰上操作，用黄枪头（200ul）取，轻轻顺着边缘插入枪头，轻轻吹打、混匀蛋白液，注意不要碰到超滤膜，然后吸收 浓缩液，每次吸靠近200ul，直到吸完。管底剩下最终一点浓缩液无须吸收，不然难度太大，有可能损坏超滤膜。最终加入MilliQ水到超滤管中，没过 超滤膜，预防膜失水变干。 7、以下是处理超滤管，反复利用超滤管步骤。 8、倒出超滤管里水，用milliQ水轻轻润洗几次，【若管底有可见蛋白沉淀，能够先加入水，然后用枪头吹打，注意不要碰到膜，吹打至沉淀悬 起，然后倒掉，不可用自来水猛冲】然后加入0.2MNaOH溶液，室温放置20min，期间平衡超滤管。再离心10min。倒出残留NaOH溶液，将 管芯浸入MilliQ水烧杯(1或2L)中,放置多个小时,再换新水,放置多个小时，不停稀释NaOH浓度。50ml管和盖子用自来水洗，内壁再用 MilliQ水洗洁净。 9、取出浸没管芯，加至靠近满MilliQ水，50ml管也加满MilliQ水，将管芯慢慢放入50ml离心管，排出部分水，然后盖上盖子，放4度保留，直到下次使用。通常来说，根据上述步骤和注意事项，每根管用三四年不会坏。 试验室常见储存液配置参数 1．30%丙烯酰胺溶液　　【配制方法】将29g丙烯酰胺和1g N，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml水中。加热至37℃溶解之，补加水至终体积为100ml。用Nalgene滤器（0.45μm孔径）过滤除菌，查证该溶液pH值应小于7.0，置棕色瓶中保留于室温。　 　【注意】丙烯酰胺含有很强神经毒性并能够经过皮肤吸收，其作用具累积性。称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也 应谨慎操作，因为它还可能会含有少许未聚合材料。部分价格较低丙烯酰胺和双丙烯酰胺通常含有部分金属离子，在丙烯酰胺贮存液中加入大约0.2体积单床 混合树脂（MB-1Mallinckrodt），搅拌过夜，然后用Whatman