WesternBlot基本原理、过程及注意事项[文].pdfVIP

W e s t e r n B l o t 基 本 原 理 、 过 程 及 注 意 事 项 原理 是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗 进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 主要有三个过程：蛋白质电泳、转膜、检测。 样品的准备 样品种类主要有培养的细胞、组织（需磨碎）、特殊细胞（切割下来的肿瘤细胞）等。 1、 裂解液主要有 RIPA 和三去污两种， RIPA 适用于细胞质中蛋白检测， 而三去污适用于总 蛋白。三去污又分为离子型和非离子型。离子型的裂解能力较强如 SDS等，非离子型的包 括 NP-40、Tritonx-100 。 2 、 裂解液的成分， 作用 试剂 增加离子强度 Nacl pH Tris-盐酸缓冲液 裂解剂 SDS 溶剂 水 蛋白酶抑制剂 PMSF、Cocktail 等 磷酸酶抑制剂 Cocktail 等 3 、 样品缓冲液 samplebuffer 作用 试剂 增加负电 SDS pH Tris 缓冲液 抗氧化 DTT 密度 甘油 指示剂 溴酚蓝 备注： 1、样品应保持低温，且实验过程应低温操作，此举为了抑制酶的活性。裂解完后样品液 会显得粘稠是长结构 DNA所致，故需要匀浆，打断 DNA。一般不用超声，因为容易引起蛋 白不可逆的变性。 2 、用 2X 样品缓冲液与样品 1：1 混匀。 4 度保存。 1 / 4 3 、样品混合液加样前需要 100℃或沸水浴加热 3-5 分钟并迅速插入冰中，以充分变性蛋 白。 配胶： 胶的主要成分为丙烯酰胺和 N ，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热 (以利于溶解双丙稀酰胺 ) 的去离子 水配制含有 29%(w/v) 丙稀酰胺和 1%(w/v)N ，N’- 亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺 29g ，N ，N- 亚甲 叉双丙稀酰胺 1g，加 H2O 至 100ml 。 )储于棕色瓶， 4 ℃避光保存。 4 、 分离胶的配方：以 20ml 的 8 ﹪分离胶为例： 2 H O 30 ﹪Acrylamide 1.5MTris （） 10XSDS 10X 过硫酸胺 (AP) TEMED 5 、 浓缩胶配方： 6ml 为例 2 H O 30 ﹪Acrylamide 1MTris 10XSDS 10X 过硫酸胺 (AP) TEMED 备注： 1、制胶是避免产生气泡，空气会影响胶的聚合，在蛋白质表观分子量分析时影响大。 2 、因为有 SDS，每次混匀时不应剧烈以免产生过多气泡。 3 、蛋白容易与 SDS脱离而失去负电荷 , 因此胶中加入 SDS为了给蛋白持续的负电荷。 4 、垫条清洗干净，与制胶板压紧，避免漏胶。 5 、制胶时，加水应缓慢不要破坏胶面，其作用：可以平衡胶面，赶气泡等。胶固定后用