实验四PCR产物的T载体克隆和转化 .ppt

医用分子生物学 实验技术;重组DNA技术操作步骤;精品资料; 你怎么称呼老师？ 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你是否会认为老师的教学方法需要改进？ 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ 教师的教鞭 “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我笨，没有学问无颜见爹娘 ……” “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”;基本原理;主要步骤： ① 制备目的基因和选择相关载体 ② 目的基因和有关载体进行连接 ③ 重组的DNA导入受体细胞 ④ DNA重组体的筛???和鉴定 ⑤ DNA重组体的扩增、表达和其他研究; 以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程; （三）PCR扩增特定基因;组织或细胞染色体DNA;;mRNA ;化学合成法获取目的基因;几种常用克隆载体的比较;三、DNA分子的体外连接——接;（一）黏性末端;（二）人工接头;（三）加入同聚体尾;（四）平端连接;5′ 3′;四、外源DNA导入宿主细胞——转; 外源基因导入宿主细胞后，筛选含有目的基因的阳性克隆并加以扩增。 所用的方法主要有遗传学方法、免疫学方法、核酸杂交法、PCR等。;1. 借助载体上的遗传标志进行筛选 (1) 利用抗生素抗性标志筛选 (2) 利用基因的插入失活/插入表达 特性筛选 (3) 利用标志补救筛选 (4)利用噬菌体的包装特性进行筛选;（一） 遗传学方法 ;插入失活筛选带有重组载体的克隆 ;;α互补筛选（蓝-白筛选） ;PCR产物的T载体克隆和转化 ;实验目的： 学习T载体的特点和PCR产物的克隆方法。 实验要求： 掌握利用T载体克隆PCR产物的方法；复习连接实验流程。 技术应用： 目的基因片段与T载体DNA连接，达到克隆基因的目的。;材料：目的基因片段（回收的PCR产物） 药品：pEMG T-Vector (Promega公司);　;质粒载体;2020/11/29;实验原理;载体结构的三大要素： 多克隆位点 选择标记（耐药性，LacZ） 独立的复制单位;pGEM-T 载体的结构;pGEM-T Easy 载体的结构;实验步骤;(2)连接实验： 在0.2ml PCR管加入以下试剂： 目的片段（100ng/ul） 3μl pGEM-T Easy（50ng/ul） 1μl T4 DNA Ligase 1μl 2×Rapid Ligation Buffer 5μl Total 10 μL 备注：混合均匀，瞬时离心。 4℃连接16小时，-20储存或直接用于转化。;说 明