分光光度技术.docVIP

实验一分光光度技术 概念 分光光度法(Spectrophoto莒raphy),又称为比色法，它是利用物质特有的吸收光 谱來鉴别物质或测定其含量的一项技术。 有色溶液对光线有选择性的吸收作用，不同物质由于其分子结构不同，对不同波 长的光的吸收能力不同，因此，每种物质都具有其特异的吸收光谱。 比色法只限于可见光区，分光光度法可扩展到紫外光区和红外光区。使用的光谱 范围 200-1000nm 紫外光区：2()0-400nm 可见光区:400-760nm 红外光区：760-1000nm 基本原理 物质的吸收光谱与它们的本身的分子结构有关，不同物质由于其分子结构不 同，对不同波长光线的吸收能力也不同。每种物质都具有特定的吸收光谱，在一 定条件下，其吸收程度与该物质浓度成正比，因此可利用各种物质不同的吸收光 谱及其强度，对不同物质进行定性和定量分析。 分光光度法根据的原理是Lambert—Beer定律，该定律阐明了溶液对单色光 吸收程度与溶液浓度及溶液厚度之间的关系。 朗伯(Lambert)定律：当单色光通过一吸收光的介质时，其光强度随吸收光 介质的厚度增加而成指数减少，即 I/I0 = e_K,L lot入射光强度， /：出射光强度，L：介质的厚度 自然对数的底，即2.718 Ki：溶液的吸光率 In (Io/I) =Kd 换算成常用对数式，即 log (Io/I) = 0.4343 - Kil 令 K = 0.4343?Kl 则 log (IO/I) =K1 此处以K为吸光率 也就是说：在溶液浓度不变吋，溶液对光的吸收随溶液厚度的增大而增大。 比尔(Beer)定律：单色光通过一光吸收介质时，光强度随介质浓度壇长而 成指数减少，即 I/Io = e_K2L C：溶液浓度 log (Io/I)=KC 也就是说：溶液厚度不变时，溶液对光的吸收随溶液浓度的增大而增大。 Lambert—Beer 定律 如果同吋考虑吸收溶液的浓度和厚度对光吸收的影响，将以上两式结合，则得出 log (Io/I)=KC1 令T 二(I/I()) A=log (I()/I) 则 A = KC1 A为吸光度，T为透光度 彳(L - mol-1 ? cnT)是一常数，即削光系数，也叫摩尔吸光度； 计算 1 ?标准管法(标准比较法) 用一己知浓度的测定物按测定管同样处理显色，读出吸光度，在根据公式计算。 Ai二K|C】L| A2=K2C2L2 A】：已知浓度标准管 A2:未知浓度测定管 A|/A2= (K]C]L|) /(k2c2l2) 因为使用的比色杯径长相同，即L!=L2,所以上式可改写为： A|/A2= (K]C|) / (K2C2) 又因另标准液和测定液小禹溶质为同一物质，所以K值相同，即：K|=K2 所以上式可改写为 A|/A2=C]/C2 所以C2= (A2/A1)C] 实验屮，由于比色皿本身和溶剂也会产生一定的光吸收，所以设置一个空白管, 即其屮除了待测溶质以外,其他的成分完全相同。以空白管对准光路对仪器调零, 消除非待测物的吸收，所测值即为待测物的光吸收。 标准曲线法 制备一系列己知不同浓度的测定物溶液，按测定管同样方法处理显色，分别 注意事项： .标准曲线是一过原点的直线 .标准曲线范围在被测定物质浓度的一半到两倍0间，并且A（吸光度）在0.05 一 1.0之间为宜。 .标准曲线仅供短期使用，应在曲线上表明操作仪器，操作者及操作吋间 ?测定标准曲线及样品需使用同一台仪器 实验屮，由于比色皿本身和溶剂也会产生一定的光吸收，所以设置一个空白 管，即其屮除了待测溶质外，其它的成分完全相同。以空白管对准光路对仪器调 零，消除非待测物的吸收，所测值即为待测物的光吸收。 三.仪器的结构 定义：对某一波长的光吸收值（吸光度）进行测定的仪器称为分光光度计。 分类：根据所测光谱范围分为：紫外、可见、红外分光光度计及万用（全波 段）分光光度计。 结构组成 光源单色器□□狭缝 光源 单色器 □ □狭缝 吸收池 检测系统 光源：要求能提供所需波长范囤的连续光谱，稳定而有足够的强度。 常用光源有：鸭灯或卤鸭灯：工作范围360—lOOOmn,用于可见光区，近紫外光 区和近红外光区 氢灯或氟灯：工作范围150-400nm,可作紫外光分光光度计的光源 分光系统（单色器）：把混合光分解为单一波长光的装置，多用棱镜或光栅作 为色散兀件，将不同波长的光分开 吸收池（比色皿、比色池）：用来盛待测溶液。一般用玻璃、石英制成。 小于330nm的光不能用玻璃比色皿，所以紫外吸收吋要用石英比色皿。 检测器：光电池、光电管、光电倍增管组成 测量装置：以电流表、波长分度盘和测量读数盘的形式输出测量结果，现代的 仪器长附有自动记录器，可自动描出记录曲线。 蛋白质化学实验 —*?双缩月尿测定蛋白含量