5感受态细胞的制备.ppt

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2021-04-03 发布于四川
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5感受态细胞的制备.ppt

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感受态细胞的制备材料、设备及试剂一. 材料 E. coli DH5α，BL21菌株 (Ampˉ)；eppendorf管。二. 设备恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作台,低温冰箱, 恒温水浴锅, 制冰机, 分光光度计,微量移液枪。三. 试剂　　1.LB固体和液体培养基　　2.含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,摇匀后铺板。 3.0.05mol/L CaCl2溶液:称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌。 4.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2: 称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌。操作步骤一、受体菌的培养从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右。二、感受态细胞的制备 ( CaCl2 法) 1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。 2、弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。 3、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。 4、感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-70℃可保存半年。 * *